研究背景：慢性肾脏病（CKD）已成为巨大的全球公共卫生挑战性问题，严重危害人类生命健康。CKD引起的系统性炎症和氧化应激，又是导致疾病进展和并发症产生的关键因素，与心脑血管疾病、恶液质、贫血及全身其他并发症密切相关。尿毒症时，肾功能丧失，体内大量代谢产物蓄积，产生尿毒症综合征，对机体造成严重危害。

随着对尿毒症毒素的深入研究，近年来将微生物代谢性毒素及外源摄入性毒素也称作肠道毒素。一些肠道毒素能够通过破坏肠上皮细胞紧密连接屏障，使更多的肠道内毒素借此穿过肠壁屏障，进入血液循环，同时也给肠道细菌移位入血创造了机会，不仅加速CKD的进展，而且导致心血管系统疾病，系统性炎症，矿物质代谢紊乱等其他全身并发症。肠道是尿毒症毒素产生的主要来源，肠道来源的毒素如吲哚、酚类、AGEs等，它们吸收入血后，通过引起炎症反应、损伤内皮细胞等不同的机制对血管造成严重损害并加速肾功能的恶化。已有许多临床研究和动物研究表明尿毒症时肠道屏障功能受损，肠上皮紧密连接结构和功能破坏。尿毒症肠上皮结构功能受损，肠道细菌代谢产生的毒害物质进入血液循环，与此同时，血中滞留的毒素物质也会通过破坏的肠上皮渗透到肠腔，进一步加重损伤，如此形成了恶性循坏。

高同型半胱氨酸血症是心血管疾病、神经退行性疾病、脑梗死、终末期肾病和多发性硬化等多种疾病的危险因素。同型半胱氨酸（Hcy）作为重要的肠源性尿毒症毒素，对心血管系统危害已经得到充分认识，但是其对肠上皮结构和功能的影响还不明确，高Hcy是否也参与了尿毒症状态下肠上皮损伤而影响肠上皮细胞的通透性尚不清楚。目前有关Hcy对肠上皮细胞的研究仍然较少，探究Hcy对尿毒症状态下肠上皮细胞结构功能的影响，对探讨尿毒症状态下肠道改变的因素及以肠道为靶点清除毒素治疗提供新思路。

研究目的：
本研究拟在建立尿毒症模型的基础上，探讨　Hcy　对尿毒症大鼠肠道通透性及肠上皮屏障结构紧密连接的影响，同时对模型大鼠给予口服益生菌进行干预，观察益生菌能否降低Hcy水平，改善肠道损伤；同时，选取肠上皮细胞Caco2进行体外实验，进一步明确Hcy对肠上皮屏障结构和功能的影响及其可能的作用机制。

研究方法：
（1）采用腺嘌呤灌胃及Hcy皮下注射的方法构建尿毒症高Hcy大鼠模型，尾静脉采血检测肾功能及肾脏组织病理观察评估动物模型；
（2）酶循环-LST试剂盒检测Hcy水平，ELISA　法检测炎症因子IL-6和TNF-α水平；采用硫代巴比妥酸缩合法测定MDA含量和黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性；
（3）使用鲎试剂动态浊度定量检测法测定内毒素和99mTc-DTPA标记的溶液检测评估肠道通透性；同时使用H&E染色观察大鼠回肠组织结构病理改变；透射电子显微镜观察大鼠肠组织和肠上皮细胞超微结构改变；　
（4）使用Transwell　小室培养肠上皮Caco2单层细胞模型，检测跨膜电阻TEER值评估细胞模型是否成功；并检测荧光黄透过率来评估肠上皮细胞的通透性；
（5）免疫荧光观察Hcy作用后肠上皮细胞Caco2紧密连接结构分子的改变；
（6）Real-time　PCR检测肠上皮细胞Caco2中紧密连接分子Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达水平；
（7）Western　blotting法对各组大鼠的回肠组织和Hcy作用后肠上皮细胞Caco2中紧密连接分子Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达水平进行检测；

研究结果：
（1）与其他实验组相比，尿毒症高Hcy模型组大鼠血清和肠组织匀浆中Hcy水平明显增高，氧化炎症因子IL-6和TNF-α水平、MDA含量也显著增高，SOD活性降低，血清内毒素水平和肠通透性显著增高；
（2）H&E染色观察回肠组织结构变化。可见生理盐水对照组的回肠组织结构基本正常，绒毛高度高，绒毛排列整齐、紧密。粘膜下层无分层或炎性细胞浸润。Hcy组肠绒毛有轻微的松动，粘膜下层可见轻度分层。尿毒症组肠绒毛断裂、排列松散，粘膜和粘膜下膜明显分离，粘膜下有大量浸润性炎症细胞向肠绒毛两侧延伸。尿毒症+Hcy组肠绒毛及黏膜下组织损伤更为严重，可见绒毛稀疏、破裂、甚至脱落，粘膜下组织分层严重，有大量炎症细胞浸润。
（3）电镜观察超微结构可见对照组肠微绒毛结构排列整齐紧密，肠上皮细胞间紧密连接结构清晰完整。Hcy组可见肠微绒毛排列略微稀疏有缝隙，轻度变细，排列基本整齐，紧密连接结构基本完整。尿毒症组可见肠微绒毛排列稀疏不规则，绒毛明显变细、变短、边缘不光滑、局部出现破裂，肠上皮细胞间紧密连接结构变细，电子密度降低、完整性破坏，肠粘膜下可见明显的水肿和胶原纤维增生。尿毒症+Hcy组肠粘膜下出现严重水肿和胶原纤维大量沉积，肠微绒毛缝隙宽大，绒毛变细、变少、出现大量绒毛断裂，肠上皮紧密连接结构变细，电子密度降低、颜色变浅、模糊，连续性被破坏。
（4）Western　blotting检测紧密连接蛋白水平，结果显示与对照组相比，Hcy组紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表达水平均降低，尿毒症组和尿毒症+Hcy组显著降低；与尿毒症组相比，尿毒症+Hcy组紧密连接蛋白水平降低更为明显。
（5）益生菌干预后，血清及肠组织匀浆中Hcy水平，内毒素水平及肠道通透性水平、氧化炎症因子水平均不同程度降低；肠组织结构病变改善，紧密连接蛋白表达量回升，提示益生菌可能通过降低Hcy水平，改善氧化炎症水平，从而降低对肠道通透性和紧密连接的破坏。
（6）对肠上皮细胞Caco2给予不同浓度的Hcy作用不同时间后，肠上皮细胞跨膜电阻降低，荧光黄通过率增大，并且呈时间和浓度依赖性改变；不同浓度Hcy作用后，细胞上清中炎症因子IL-6和TNF-α的释放量随着作用浓度增高而增大，MDA含量、LDH活性、ROS释放量也不同程度的增加；
（7）免疫荧光结果显示Hcy作用后，细胞密度显著降低，肠上皮细胞之间蜂巢状排列破坏，荧光信号明显减弱,　细胞之间缝隙增大，局部成片状分布，并呈现信号强弱不等的异常分布。电子显微镜观察可见上皮细胞肠绒毛排列出现紊乱、稀疏、局部有断裂甚至脱落，粘膜下有炎症细胞浸润，细胞间连接结构电子密度降低、结构不完整，出现断裂，浓度越高，改变越严重。
（8）Hcy作用后，肠上皮细胞紧密连接分子Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表达水平降低，并且随着Hcy作用浓度越高，下降程度越显著。
（9）Hcy作用后，肠上皮细胞通透性增大，紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达水平降低；Caco2细胞中MLCK的mRNA表达量显著增高，p-p38　MAPK、ATF-2、MLCK、MLC2、p-MLC2蛋白表达量也均增高，使用p38MAPK抑制剂和siRNA预处理干预后，细胞中MLCK的mRNA表达量降低，p-p38　MAPK、ATF-2、MLCK、MLC2、p-MLC2蛋白表达量有不同程度降低，紧密连接蛋白表达量增加，上皮细胞通透性降低；以上结果提示Hcy可能通过诱导氧化炎症损伤激活p38　MAPK-ATF-2-MLCK-MLC/pMLC　通路，导致肠上皮细胞紧密连接损伤，通透性增大。

研究结论：
（1）同型半胱氨酸能够通过诱导氧化炎症因子的释放，增加肠道损伤氧化炎症水平，加重尿毒症大鼠肠上皮紧密连接的破坏和肠道通透性的增加；
（2）复合益生菌制剂VSL#3能够降低尿毒症大鼠血清和肠道组织中的Hcy水平，减轻Hcy诱导的炎症反应和氧化损伤，改善尿毒症大鼠肠上皮屏障功能。
（3）同型半胱氨酸能够引起肠上皮Caco2单层细胞模型通透性增加，并导致紧密连接分子表达下降，且这种影响呈时间和剂量依赖性；
（4）Hcy可能通过诱导氧化炎症反应，激活p38MAPK-ATF-2-MLCK-MLC　2/p-MLC2　信号通路，参与肠黏膜上皮细胞屏障功能和通透性的调控过程。