背景：
急性髓系白血病是起源于髓系造血干细胞的恶性克隆性疾病，临床表现为贫血、出血、感染和浸润等，根据FAB分型将急性髓系白血病分为M0-M7八种类型，其中急性单核细胞白血病(AML-M5)具有高白细胞、髓外浸润、完全缓解率低，无病存活时间短等临床特点。miRNA是一类内源性长度约为22个核苷酸的小分子RNA，在细胞发育、增殖、分化、凋亡等生物过程中发挥重要作用。随着高通量测序及基因芯片等技术的发展，研究发现miRNA作为肿瘤早期诊断、预后及疗效预测的分子标记物具有重要意义，且基于miRNA的靶向治疗也显示出巨大前景。
目的：
本课题通过二代高通量测序方法研究miRNA在急性单核细胞白血病中的表达谱，扩大样本进一步验证miR-495-3p表达水平及其功能，为深入认识miRNA在急性单核细胞白血病中发生、发展及耐药等作用奠定基础。
方法：
1.　临床分别收集初诊急性单核细胞白血病和缺铁性贫血患者骨髓标本各5例，分别提取RNA，运用Illumina　Genome　Analazer　IIx行miRNA测序，结合生物信息学分析建立急性单核细胞白血病差异表达miRNA谱。
2.　应用实时定量PCR检测65例初诊急性单核细胞白血病和32例缺铁性贫血骨髓细胞中miR-495-3p表达情况，分析miRNA-495-3p与初诊急性单核细胞白血病患者临床特征的相关性。
3.　在急性单核细胞白血病细胞系中通过慢病毒转染过表达miR-495-3p，应用miRNA靶基因预测软件Targetscan、miRanda、miRDB、miRwalk、DIANA-microT和RNA22等预测miR-495-3p的靶基因，通过western　blot验证miR-495-3p的靶基因，最后通过双荧光素酶实验验证miRNA与靶基因之间的直接调控作用。
4.　观察过表达miR-495-3p对急性单核细胞白血病细胞增殖、凋亡、周期、迁移及侵袭等功能的影响，检测不同浓度硼替佐米、葡萄糖调节蛋白GRP78抑制剂HA15对急性单核细胞白血病细胞系的抗肿瘤作用，并研究两种药物联合效应，进一步验证不同浓度硼替佐米作用时miR-495-3p对GRP78表达的调控及miR-495-3p对硼替佐米的增敏效应。
结果：
1.　本研究应用miRNA二代高通量测序检测5例初发急性单核细胞白血病患者与5例缺铁性贫血对照患者骨髓标本中miRNA的表达水平，结果发现共有33个上调的miRNA，61个下调的miRNA，通过生物信息学分析差异表达miRNA，应用聚类分析图、火山图、染色体分布等分析miRNA表达水平及分布状况。
2.　收集了65例初发急性单核细胞白血病患者和32例缺铁性贫血患者骨髓标本，应用实时定量PCR技术检测结果显示miRNA-495在急性单核细胞白血病患者显著低表达(P＜0.01)，且miRNA-495表达水平与急性单核细胞白血病患者骨髓中原始细胞及单核细胞比例具有相关性。
3.　应用慢病毒转染成功构建miR-495-3p过表达稳定株，通过miRNA在线的靶基因预测软件预测靶基因，选定HSP90、ST3GAL6、GRP78和Mcl-1基因进一步验证，通过Western　blot及双荧光素酶实验证实GRP78是miR-495-3p下游直接调控靶基因。
4.　在急性单核细胞白血病细胞系THP-1和U937中，miRNA-495具有抑制白血病细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡功能，硼替佐米与GRP78抑制剂对急性单核细胞白血病细胞均具有杀伤作用，呈剂量和浓度依赖性，且两种药物在不同浓度联合使用时具有协同作用，此外miR-495-3p可以促进硼替佐米对急性单核细胞白血病细胞的抗肿瘤作用，因此miR-495-3p可能通过下调GRP78表达增强硼替佐米对急性单核细胞白血病细胞的抗肿瘤作用。
结论：
本研究通过二代高通量测序分析急性单核细胞白血病的miRNA表达谱，扩大临床标本验证后发现miR-495-3p在初发急性单核细胞白血病患者中显著低表达。功能研究显示miR-495-3p具有抑制白血病细胞增殖、迁移、侵袭及促进凋亡的功能，而且miR-495-3p可能通过下调GRP78增强硼替佐米对急性单核细胞白血病抗肿瘤作用。本论文围绕miRNA在急性单核细胞白血病的表达谱及miR-495-3p的功能研究为主题，为深入认识miRNA在急性单核细胞白血病中发生、发展及耐药等作用奠定基础。