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本发明公开了一种长非编码RNA及其在诊断及治疗神经胶质瘤中的应用，所述长非编码RNA为lncRNA LINC00689，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。本发明提供了一种诊断神经胶质瘤的分子标志物lncRNA LINC00689，通过检测发现lncRNA LINC00689在神经胶质瘤患者肿瘤中高表达，因此通过检测神经胶质瘤患者中的lncRNA LINC00689表达能够实现神经胶质瘤的早期诊断从而提高神经胶质瘤患者生存率，而且本发明所提供的lncRNA LINC00689基因标志物具有优异的诊断价值。

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本发明公开了一种长非编码RNA及其在诊断及治疗肝癌中的应用，所述长非编码RNA为长非编码RNA lncRNA MAPKAPK5‑AS1，基因ID为ENSG00000234608，定位于12q24.12，长非编码RNA lncRNA MAPKAPK5‑AS1的核苷酸序列如Seq IDNO.1所示。本发明首次发现lncRNA MAPKAPK5‑AS1可作为肝癌诊断生物标志物和药物治疗靶点，并提供了MAPKAPK5‑AS1/PLAGL2/HIF‑1α环路可作为肝癌的诊断和治疗靶点。lncRNA MAPKAPK5‑AS1在肝癌组织中显著上调，MAPKAPK5‑AS1抑制可抑制HCC细胞的增殖，迁移和EMT，并诱导细胞凋亡。

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本发明公开了一种长非编码RNA及其在诊断及治疗原发性肝癌中的应用，所述长非编码RNA为长非编码RNA LINC01123，长非编码RNA LINC01123的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。本发明首次提出LINC01123在肝癌中的作用机制，并提出LINC01123在评估HCC患者预后情况以及作为HCC患者药物治疗靶标方面有着巨大的潜力，并提供用于诊断HCC预后情况或作为治疗HCC药物治疗的靶点，为HCC病人精准治疗的实现奠定了基础。

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研究目的： 白血病是一类白细胞因增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制，获得不限制的自我更新能力，导致白细胞在骨髓或血液中恶性增殖的疾病。其中，急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）的发病原因和病理机制非常复杂，是多种类型的突变协同作用的结果。因此，研究AML发生发展的分子机制对寻找新的治疗手段和策略，提高患者生存期具有重要意义。 长链非编码RNA是指长度大于200nt的一类非编码RNA，在肿瘤发展进程中可作为原癌或抑癌基因调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移等，对癌症的发生、发展及转移起到了重要的作用。NEAT1是近年来新发现的一种癌症相关的长链非编码RNA，在癌症发展进程中主要通过调控miRNA发挥作用。miRNA是一大类非编码RNA，一般是由22nt组成的单链分子，其中miR-194-5p可靶向作用于多种基因的3’端非编码区参与上皮间质转化，介导肿瘤转移与侵袭。 研究表明，NEAT1在大多数实体瘤中过表达，但在白血病中表达水平下调，并且可通过抑制全反式维甲酸的促分化功能促进白血病的发生发展。同时，miR-194-5p与白血病的发生发展也密切相关，其表达水平异常显著影响造血祖细胞的分化。NEAT1同样参与miR-194-5p表达水平的调控，在卵巢癌和骨肉瘤中，NEAT1靶向作用于miR-194-5p影响细胞的增殖、转移和耐药产生，但两者在白血病中是否存在某种协同关系目前尚未报道。因此，探索NEAT1与miR-194-5p在AML中的作用靶点和调控机制，对于AML的诊断、治疗和预后至关重要。 近些年来，人们对AML的发生机制、治疗手段和耐药等研究取得了显著成果，但成人AML的存活率仍然很低，因此深入了解AML的病理机制以及相关的分子信号通路对疾病的治疗和预防至关重要。现已发现一些长非编码RNA在调控AML发生发展中的调控机制，但是由于其种类繁多、调控机制复杂，需探索更多的相关生物机制和信号通路，为开发更好的肿瘤治疗策略奠定基础。本课题旨在明确长非编码RNA NEAT1与miR-194-5p在AML中的表达水平，并在细胞系水平进行验证，进一步分析两者对AML细胞增殖、凋亡以及侵袭性的影响，并探讨两者间可能的相互作用关系，为白血病的治疗提供新的靶点与思路。 研究方法： 1. 利用荧光定量PCR检测30例临床确诊的AML患者及30例正常对照者外周血中NEAT1与miR-194-5p的表达水平，并在AML细胞HL-60和正常对照组外周血单个核细胞中进一步验证。 2. 利用RNA结合蛋白免疫沉淀技术确定NEAT1与miR-194-5p的作用关系，对两者可能的作用机制进行讨论。 3. 利用分子生物学相关技术，在HL-60细胞中分别外源性过表达NEAT1与miR-194-5p，利用软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，以及Western blot检测凋亡信号蛋白和侵袭转移相关蛋白的表达，从而对可能的作用机制进行研究探索。 研究结果： 1. NEAT1与miR-194-5p在AML中的表达 分别采集30例健康正常对照和30例AML患者外周血，采用qRT-PCR检测NEAT1与miR-194-5p的表达情况，结果显示NEAT1与miR-194-5p在AML患者外周血中的表达都发生了下调。接着，利用AML细胞系HL-60，以正常人外周血来源的单个核细胞作为正常对照，进一步在细胞水平验证了NEAT1与miR-194-5p的表达变化，其结果与临床标本的表达趋势一致，且具有统计学意义（P < 0.05）。以上结果提示，NEAT1与miR-194-5p的异常表达可能与AML的发生发展密切相关。 2. NEAT1与miR-194-5p的相互关系 利用Ago2-RIP技术检测NEAT1与miR-194-5p是否存在相互作用。RIP是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，Ago2是RISC复合体的主要蛋白。我们利于抗Ago2抗体把RNA-蛋白复合物沉淀下来，对沉淀中的NEAT1和miR-194-5p进行qRT-PCR检测，分析其富集情况。结果表明，NEAT1和miR-194-5p都可与Ago2蛋白结合，在Ago2中显著富集。Starbase是中山大学开发的lncRNA/circRNA/microRNA等研究的数据库，根据Starbase2.0提示，NEAT1和miR-194-5p碱基序列存在互补位点。 3. NEAT1与miR-194-5p的转染 为进一步研究NEAT1与miR-194-5p在AML中的作用，构建过表达质粒，通过脂质体转染法实现细胞中上调NEAT1的表达，细胞分组为：pcDNA-NEAT1组、pcDNA组；设计合成NEAT1的小干扰RNA，并使用无意义链作对照，通过脂质体转染实现HL-60细胞中下调NEAT1的表达，细胞分组为：si-NEAT1组、si-NC组。同时，通过脂质体转染法将miR-194-5p模拟物和miR-194-5p抑制剂以及阴性对照转染HL-60细胞，上调或下调细胞中miR-194-5p的表达，细胞分组为：miR-194-5p mimics组、NC-mimics组、miR-194-5p inhibitor组和NC inhibitor组。转染48小时后取3孔细胞提取RNA分别检测转染效果，实验组与对照组相比各表达量都有显著差异（P＜0.01），说明转染成功。 4. NEAT1与miR-194-5p促进细胞凋亡 通过流式细胞Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平，进一步探索NEAT1与miR-194-5p对细胞生物学功能的影响。结果表明，与转染空载体以及阴性对照相比，NEAT1与miR-194-5p的上调表达都可促进细胞的凋亡，其早期与晚期凋亡细胞的总百分比分别从9.68 %升到27.47 %，13.91 %升到32.06 %。 5. NEAT1与miR-194-5p抑制细胞增殖 利用软琼脂克隆形成检测分别过表达NEAT1与miR-194-5p后细胞的增殖情况，进一步探索NEAT1与miR-194-5p对细胞生物学功能的影响。实验结果表明，相比于空转染组和阴性对照组，上调NEAT1与miR-194-5p的表达可显著抑制细胞增殖能力。 6. NEAT1与miR-194-5p抑制细胞侵袭 利用Western blot检测AML细胞侵袭相关蛋白Vimentin、E-Cad、N-Cad以及凋亡分子Caspase-3的表达水平，验证NEAT1与miR-194-5p对HL-60细胞侵袭能力的影响。结果显示，过表达NEAT1或miR-194-5p后，Vimentin、N-Cad的表达下调，E-Cad的表达显著上调，提示HL-60细胞的侵袭能力受到抑制。此外，Caspase3表达上调，细胞凋亡增加。而敲降NEAT1则逆转了以上这种效应。同样，过表达miR-194-5p后细胞侵袭相关蛋白的表达情况同过表达NEAT1后的结果一致，敲降miR-194-5p也逆转了这种效应。本部分实验结果表明，NEAT1与miR-194-5p能够抑制AML的侵袭进展。 结论： 1. NEAT1与miR-194-5p在AML中表达下调。 2. NEAT1与miR-194-5p在AML中抑制细胞的增殖和侵袭转移，促进细胞凋亡。 3. NEAT1与miR-194-5p协同调控AML的发生发展。 关 键 词：NEAT1；miR-194-5p；急性髓系白血病；增殖；凋亡；侵袭性 论文类型：应用基础

Keyword ：

miR-194-5p NEAT1 凋亡 急性髓系白血病 侵袭性 增殖

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背景： 研究表明，70%-90％的人类基因组能够被普遍转录，但只有总基因组不到2%的基因具有编码蛋白质的能力，非编码RNA占人类转录组的大多数。长非编码RNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在表观遗传、转录、转录后调控等多个层面上调控基因的表达，参与癌症发生发展，与化疗耐受等相关。miRNA是一类转录本长度约为21~25个核苷酸的非编码RNA，具有高度的保守性、时序性和组织特异性；通过与靶基因mRNA 3'端非翻译区的序列互补配对，调节靶基因的表达，从而参与肿瘤生长、侵袭、血管生成、甚至免疫逃避。 UCA1是本实验室采用RACE技术发现的一个长非编码RNA，体内外实验证实该基因与膀胱肿瘤密切相关。课题组进一步研究发现UCA1通过激活磷酸化的AKT，上调CREB的表达与活性，经由PI3K信号转导通路，调控膀胱癌细胞的周期。 近年来，许多针对非编码RNA的研究表明，长链非编码RNA和miRNA可以通过相互调控，在肿瘤的形成和恶性进展中发挥重要作用。miRNA参与UCA1在膀胱癌发生发展中的作用机制，还有待进一步研究。 目的： 筛选与UCA1相互作用的miRNA，探讨UCA1调节miRNA在膀胱癌恶性进展中的作用机制，为临床治疗提供潜在的作用靶点。 方法： 1. 提取实验室自建的敲低UCA1表达的膀胱癌5637细胞（shRNA UCA1）和对照细胞（shRNA Con）的总RNA，通过高通量测序技术筛选出在这对细胞中差异表达的miRNA；预测差异表达miRNA的靶基因，并对靶基因做进一步的GO和KEGG Pathway分析。 2. 在稳定敲低、过表达UCA1的膀胱癌细胞（shRNA UCA1、pCDNA3.1-UCA1）和对照细胞（shRNA Con、pCDNA3.1）中，采用荧光定量PCR验证差异表达miRNA与UCA1的相关性。 3. 选择实验证实的8个miRNA（miR-574-5p、let-7d-3p、miR-196a-5p、miR-199a-3p、miR-221-5p、miR-148a-3p、miR-99b-3p、miR-532-5p）做进一步生物信息学分析；预测它们的转录因子、靶基因，并对候选靶基因做进一步的GO和KEGG Pathway分析；构建TF-miRNA-mRNA调控网络，统计调控网络图中的重要转录因子和靶基因。 4. 根据生物信息学分析结果，在稳定敲低、过表达UCA1的膀胱癌细胞株与对照细胞、膀胱癌组织标本与对照组织中，采用荧光定量PCR验证UCA1、miR-196a-5p、p27kip1三个基因表达的相关性。 5. 在稳定敲低、过表达UCA1的膀胱癌细胞和对照细胞中，采用Western blot检测p27kip1的蛋白表达；在膀胱癌组织标本和对照的石蜡切片中，采用免疫组化检测p27kip1的蛋白表达。 结果： 1. 高通量测序发现75个表达有显著差异的miRNA，其中38个在敲低表达UCA1的膀胱癌细胞株中表达上调，37个表达下调；75个差异表达miRNA的预测靶基因共有36008个；KEGG Pathway分析发现预测靶基因显著富集在嘧啶代谢、嘌呤代谢、次级代谢产物的生物合成、细胞内吞、血管内皮生长因子通路、MAPK信号通路、ECM受体相互作用等信号通路。 2. 实验证实5个miRNA的表达与UCA1正相关，6个miRNA的表达与UCA1负相关，表达差异与测序结果一致。 3. 8个miRNA的预测转录因子145个，候选靶基因928个。GO分析发现候选靶基因主要富集在细胞器、细胞质、膜结合细胞器、细胞质mRNA、RNA颗粒等10个细胞组成功能；参与蛋白结合的分子功能；涉及神经元发育分化、细胞发育分化、细胞过程的负调节、细胞质蛋白代谢、生物过程的负调节等111个生物过程。KEGG Pathway分析发现候选靶基因显著富集在蛋白聚糖信号通路、ErbB信号通路、ECM受体的相互作用通路、PI3K-AKT信号通路等。根据TF-miRNA-mRNA调控网络图，挖掘出可能调控8个miRNA的重要转录因子有AP1、BRCA1、NFKB1、CREB、MYC等；可能受8个miRNA调控的重要靶基因有CALM3、HIF1A、EPO、P27kip1、IGF1等。 4. 在敲低UCA1表达的膀胱癌5637细胞中，UCA1与miR-196a-5p表达下调，而p27kip1 mRNA表达上调，p27kip1蛋白表达明显增加；在过表达UCA1的膀胱癌细胞UMUC-2中，UCA1和miR-196a-5p表达上调，而p27kip1 mRNA表达下调，p27kip1蛋白表达明显减少。 5. UCA1、miR-196a-5p在膀胱癌组织中的表达量明显高于非癌组织，而p27kip1 mRNA相反，p27kip1蛋白在膀胱癌组织石蜡切片中的表达量明显低于非癌组织；UCA1与miR-196a-5p在膀胱癌组织中表达正相关，而UCA1和miR-196a-5p与p27kip1 mRNA在膀胱癌组织中的表达负相关。 结论： 1. 筛选出75个可能与UCA1相关的miRNA，实验证实11个miRNA的表达与UCA1密切相关。 2. 构建与UCA1密切相关的miRNA的TF-miRNA-mRNA调控网络图，挖掘出重要的转录因子和靶基因；发现UCA1与PI3K-AKT信号通路密切相关；CREB是miR-196a-5p的转录因子，p27kip1是它的靶基因。 3. 在膀胱癌细胞和组织中证实，UCA1与miR-196a-5p表达正相关，UCA1和miR-196a-5p表达与p27kip1负相关。 4. 结合课题组前期研究成果，UCA1通过激活磷酸化AKT，增强CREB的表达与活性，从而上调miR-196a-5p，靶向抑制p27kip1的表达，参与PI3K-AKT信号通路。

Keyword ：

miR-196a-5p miRNA p27kip1 UCA1 长非编码RNA

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研究背景： 宫颈癌在全世界女性常见的生殖系统恶性肿瘤中排名第三，严重威胁女性健康，而我国宫颈癌发病率仅次于智利高居世界第二，且发病年轻化趋势明显。根据一些流行病学和生物学研究，人乳头状瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌发展中的主要病因，超过95%的宫颈癌和宫颈上皮内瘤变活检中检测到HPV DNA，表明这种癌症与HPV感染有极大相关性，而HPV感染致病主要归因于其癌相关蛋白E6/E7，E6蛋白能诱导p53降解，抑制p53依赖性信号传导并促进肿瘤发生，E7蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21有关，促使细胞无限增殖而癌变，E6/E7致病过程中受到多种分子的调控，如癌症相关蛋白、微小RNA(microRNA)、循环RNA(circRNA)以及长非编码RNA(lncRNA)等。 长非编码RNA是一类长度大于200 bp，无蛋白编码能力的类mRNA样转录本，在细胞中可通过转录水平、转录后水平、表观遗传水平等多种方式发挥作用。长非编码RNA与肿瘤关系密切，其在控制肿瘤细胞周期、凋亡和代谢等过程中发挥着举足轻重的作用。多种长非编码RNA，如H19、HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA , HOTAIR）、肺腺癌转移相关转录本1（Metastasis-associated lung adenocarcinoma, MALAT1）、母系表达基因3（maternally expressed gene 3, MEG3）等都与宫颈癌HPV之间存在某种调控关系。 尿路上皮癌胚抗原1（UCA1）是本课题组前期发现的原癌性长非编码RNA，其在膀胱肿瘤组织和细胞中高表达，参与膀胱癌增殖、侵袭迁移、糖代谢、化疗耐药等多种生物学功能的调节。随后，多个研究表明，UCA1在膀胱癌、舌鳞状细胞癌、卵巢癌、乳腺癌和肝癌等多种癌症中均有不同程度的高表达，这意味着UCA1可能在人类癌症中扮演着一个重要角色。目前，LncRNA与病毒感染之间的关系也成为了研究的关注热点，比如：呼吸道合胞病毒（HSV）感染的细胞中lncRNA MEG3表达水平降低，丙肝病毒抑制IGF2-AS的表达，lncRNA NEAT1、7SK促进HIV病毒复制，甲型流感病毒(IAV)抑制lncRNA VIN的表达，有一项研究表明，乙肝病毒通过调控LncRNA UCA1促进肿瘤发生，而UCA1 是否与宫颈癌HPV之间存在某种调控关系尚未可知。 研究目的： 明确在宫颈癌HPV致病过程中E6/E7与UCA1之间的调控反馈关系，初步探讨HPV影响宫颈癌SiHa细胞增殖的分子机制，为宫颈癌预防和治疗寻求潜在新靶点和新策略。 研究方法： 1）以HPV16(+)SiHa、HPV18(+)Hela、HPV(-)C33A宫颈癌细胞为研究对象，利用RT-PCR检测细胞中UCA1 mRNA表达水平，Western blotting检测三株细胞中p27蛋白的表达情况。 2）构建gRNA表达质粒，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建稳定敲除HPV16 E6和E7的HPV16(+) SiHa细胞，利用RT-PCR检测UCA1 mRNA表达水平的变化，Western blotting检测p27蛋白表达水平的变化。 3）构建gRNA表达质粒，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除UCA1的HPV16(+) SiHa细胞，利用RT-PCR和Western blotting检测HPV16 E6/E7 mRNA和p53、p21蛋白水平表达的变化。 4）在敲除HPV16 E6/E7的HPV16(+)SiHa细胞中，利用CCK8细胞增殖与毒性实验和平板克隆形成实验检测SiHa细胞的增殖水平，并在SiHa细胞中过表达UCA1后检测细胞的增殖水平的变化。 研究结果： 1）在宫颈癌HPV16 (+) SiHa细胞、HPV18 (+) Hela细胞和HPV(-)C33A细胞中发现，HPV16/18(+)的SiHa细胞/Hela细胞UCA1 mRNA的表达水平明显高于HPV(-)C33A细胞，HPV16/18(+)的SiHa细胞/Hela细胞p27蛋白的表达水平低于HPV(-)C33A细胞，RNA水平和蛋白水平上检测结果一致。 2）在敲除HPV16 E6的宫颈癌细胞SiHa中发现，UCA1 mRNA表达下调，p27蛋白的表达水平上调，在敲除HPV16 E7的宫颈癌细胞SiHa中，UCA1 mRNA表达下调，p27蛋白的表达水平上调；而在敲除UCA1的宫颈癌细胞SiHa中， HPV16 E6、 E7 mRNA水平未有明显变化，p53、p21蛋白水平也未见明显变化。敲除HPV16 E6/E7抑制SiHa细胞UCA1的表达，而敲除UCA1不影响SiHa细胞HPV16 E6/E7的表达，表明HPV16 E6/E7调控UCA1的表达。 3）在敲除HPV16 E6的宫颈癌SiHa细胞中，细胞增殖能力减弱，敲除HPV16 E7的宫颈癌SiHa细胞的增殖能力也减弱；而敲除HPV16 E6/E7同时过表达UCA1，相比于对照组，SiHa细胞增殖能力增高。 结论： 1）UCA1表达与HPV感染有相关性，HPV16 E6/E7是UCA1的上游分子，并调控UCA1的表达。 2）UCA1对HPV16 E6/E7无反馈作用。 3）通过干预UCA1可以降低HPV16 E6/E7对宫颈癌细胞促进增殖的作用。

Keyword ：

HPV UCA1 长非编码RNA 宫颈癌 增殖

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摘 要 研究背景： 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，我国的膀胱癌发病率呈增长趋势。75~80％的膀胱癌被诊断为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），其余为肌层浸润性膀胱癌（MIBC）。NMIBC可通过经尿道切除术治愈，但仍有部分患者进展为肌层浸润性疾病，其预后明显较差。诊断监测膀胱癌主要利用膀胱镜检查，但具有侵入性且价格较昂贵。因此，需要深入研究膀胱癌的发生发展机制，为膀胱癌的诊断和治疗提供新的标志物与方法。 肿瘤细胞代谢异常的现象由来已久，早在1920年，生物化学家 Otto Warburg就发现尽管在氧气充足的条件下，肿瘤细胞也偏好使用糖酵解来产生能量，这种异常的代谢方式被称为“ Warburg效应”。21世纪以后，有研究发现肿瘤细胞的脂质代谢与氨基酸代谢等也发生了改变，其中包括谷氨酰胺代谢，它对于肿瘤的发生、增殖及转移至关重要。在肿瘤细胞中，谷氨酰胺代谢不仅可为细胞提供 ATP，还可以提供原料来帮助细胞合成所需的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等，并在细胞的增殖、平衡氧化还原稳态、信号通路、细胞的凋亡以及自噬中具有重要作用。因此，对其相关调控机制的研究也成为了肿瘤研究的热点。 长非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200 bp，但无蛋白编码能力的转录本。其可通过多种机制与DNA、RNA、蛋白质相互作用而发挥功能。lncRNA与肿瘤的增殖、分化、凋亡和转移等密切相关。近年来多项研究表明lncRNA参与肿瘤代谢重编程，但lncRNA调控谷氨酰胺代谢的研究较少。 我们前期的研究发现lncRNA UCA1在膀胱癌代谢重编程方面也扮演着重要角色， UCA1可以通过激活mTOR-STAT3通路或/和抑制miR-143的表达，上调HK2的表达，从而促进膀胱癌细胞的有氧糖酵解；可以通过miR-195 / ARL2信号通路促进膀胱癌细胞线粒体功能；还可以上调膀胱癌细胞GLS2的表达，同时促进谷氨酰胺的吸收。而UCA1是否调控谷氨酰胺代谢中其他分子特别是调节谷氨酰胺转运的转运体还需进一步深入研究。 研究目的： 明确谷氨酰胺对膀胱癌细胞生长的重要性，分析UCA1对谷氨酰胺代谢的相关分子的影响，证实UCA1可以通过调控谷氨酰胺转运体影响膀胱癌细胞增殖，并研究其调控机制，为膀胱癌诊断与治疗提供新的思路。 研究方法： 1. 利用四种条件培养基（无糖无谷氨酰胺，有糖无谷氨酰胺，无糖有谷氨酰胺，有糖有谷氨酰胺）分别对四种膀胱癌细胞（5637、T24、BLS-211、UMUC2）进行培养，通过CCK8以及平板克隆实验分析这四种条件培养基对膀胱癌细胞增殖的影响。 2. 分别构建高表达UCA1和敲低UCA1的膀胱癌细胞，用qRT-PCR及Western blotting检测谷氨酰胺代谢相关分子包括谷氨酰胺转运体（SLC1A5、SLC7A5、SLC38A2），谷氨酰胺酶（GLS1、GLS2），谷氨酸脱氢酶（GLUD1），谷丙转氨酶（GPT2），谷草转氨酶（GOT2）的mRNA和蛋白表达变化，并利用细胞免疫荧光实验对SLC1A5进行定位表达分析。 3. 利用CCK8实验检测高表达UCA1和敲低UCA1的膀胱癌细胞的增殖变化；同时合成SLC1A5 siRNA，敲低膀胱癌细胞中SLC1A5的表达，检测其对细胞增殖能力的影响；在高表达UCA1的膀胱癌细胞中敲低SLC1A5，检测细胞的增殖变化，分析UCA1与 SLC1A5影响膀胱癌细胞增殖的上下游关系。 4. 利用Western blotting检测高表达UCA1和敲低UCA1的膀胱癌细胞p-mTOR的水平，同时，检测敲低SLC1A5的膀胱癌细胞中p-mTOR的水平。 实验结果： 1. 四种膀胱癌细胞在无谷氨酰胺有或无糖的培养基中无法生长，在有谷氨酰胺有或无糖的培养基中均可以生长，且在无糖有谷氨酰胺的培养基中细胞增殖能力低于有糖有谷氨酰胺的培养基。 2. 在T24细胞中敲低UCA1后，SLC1A5与GLS2的mRNA及蛋白表达下调，且细胞膜上SLC1A5的荧光减弱；而在UMUC2细胞中高表达UCA1后，SLC1A5与GLS2的mRNA及蛋白表达上调，且细胞膜上SLC1A5的荧光增强。 3. 在T24细胞中敲低UCA1后，细胞增殖能力减弱；在UMUC2细胞中高表达UCA1后，细胞增殖能力增强；在UMUC2细胞中敲低SLC1A5，可以降低细胞的增殖能力；在UMUC2细胞中高表达UCA1后再敲低SLC1A5，可以逆转UCA1促进细胞增殖的作用，使细胞增殖减弱。 4. 在T24细胞中敲低UCA1后， p-mTOR水平下调；在UMUC2细胞中高表达UCA1后，p-mTOR水平上调；而在UMUC2细胞中敲低SLC1A5后，p-mTOR水平无明显改变。 结论： 1. 谷氨酰胺是膀胱癌细胞增殖所必需的营养物质，体外培养的膀胱癌细胞对谷氨酰胺的依赖大于对葡萄糖的依赖。 2. LncRNA UCA1可以促进膀胱癌细胞谷氨酰胺转运体SLC1A5和谷氨酰胺酶GLS2的表达。 3. UCA1促进膀胱癌细胞增殖可以通过调控SLC1A5的表达来实现，而这一过程与mTOR的磷酸化无关。

Keyword ：

SLC1A5 UCA1 膀胱癌 长非编码RNA 增殖

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目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中长非编码RNA SBF2-AS1的表达及临床意义.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测1 14例新鲜NSCLC组织标本及相对应的正常癌旁组织标本中SBF2-AS1的表达,分析其与NSCLC临床病理特征及诊断和预后的关系.结果 SBF2-AS1在NSCLC组织中的表达(4.336±0.032)显著高于癌旁正常组织(1.256±0.021),差异有统计学意义(f=3.594,P=0.005).SBF2-AS1表达与NSCLC的肿瘤大小(x2=13.072,P=0.001)、淋巴结转移(x2=6.896,P=0.009)、疾病分期(x2=8.566,P=0.003)、吸烟史(x2=8.769,P=0.003)、浸润深度(x2=17.852,P=0.001)有关,而与年龄(x2=0.141,P=0.707)、性别(x2=0.036,P=0.850)、病理类型(x2=1.267,P=0.260)无关.受试者工作特征(ROC)曲线分析显示曲线下面积为0.853(95％CI为0.755 ～0.879,P=0.004),敏感性和特异性分别为52.4％和87.8％.SBF2-AS1低表达和高表达组患者在中位总生存时间的差异具有统计学意义(42.3个月∶25.2个月x2=4.753,P=0.013).结论 SBF2-AS1在NSCLC中高表达,可作为治疗NSCLC的新型生物标志物和诊断靶标.

Keyword ：

SBF2-AS1 病理学,临床 肺肿瘤 生物学标记,药理学

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摘 要 研究背景： 肿瘤是一种复杂的代谢性疾病，其发生发展是糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢以及线粒体代谢等多种代谢因素综合调控的结果。糖代谢是诸多代谢因素中影响较大、调控作用较为显著的一类。肿瘤细胞的糖代谢有别于其它正常细胞，表现为即使在氧供充足的条件下也主要通过糖酵解途径快速摄取能量，以满足肿瘤细胞的过度生长。肿瘤的这一糖代谢特点称为Warburg效应，和其它代谢一样，糖代谢最终也可归属于能量代谢，其终极目的都是为肿瘤细胞提供赖以生存的能量。自噬是肿瘤细胞内对能量变化较为敏感的生物学反应，受细胞内氧化应激等一系列活动的调节，对ATP及ROS变化水平极为敏感。肿瘤形成过程中，细胞自噬为肿瘤细胞提供更丰富的营养，促进肿瘤生长。肿瘤自噬的发生也受到多种信号通路与分子的调控，如AMPK/mTOR信号通路、LncRNA、miRNA等。 长非编码RNA是一类长度大于200 bp，无蛋白编码能力的类mRNA样转录本，在细胞中可通过转录水平、转录后水平、表观遗传水平等多种方式发挥作用。大量研究表明长非编码RNA与肿瘤关系密切，其在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡和转移等多种生物学过程中发挥重要调节功能。但是，具体参与肿瘤自噬调控的长非编码RNA分子及其调控机制尚未完全阐明。 UCA1是本课题组前期发现的原癌性长非编码RNA，其在膀胱肿瘤组织和细胞中高表达，参与膀胱癌增殖、侵袭迁移、耐药等多种生物学功能的调节。特别是本课题组近期发现UCA1可，通过mTOR/STAT3/miR-143/HK2通路促进糖酵解，调节膀胱癌细胞Warburg效应，提示UCA1是膀胱癌代谢的重要调控分子。但是，UCA1是否参与调控膀胱癌细胞自噬，及其具体的作用机制都尚未明确。 研究目的： 明确UCA1对膀胱癌细胞自噬的作用，初步探讨UCA1调控膀胱癌细胞自噬的分子机制，为UCA1作为膀胱癌治疗的潜在靶点提供理论与实验依据。 研究方法： 1）构建过表达UCA1和敲低UCA1的膀胱癌细胞系，RT-PCR及Western blot检测自噬标志物LC3、ATGs的mRNA和蛋白表达变化；吖啶橙荧光染色及RFP-GFP LC3自噬双标腺病毒免疫荧光检测自噬体及自噬溶酶体。 2）在稳定过表达及敲低UCA1的膀胱癌细胞系中检测ATP、ROS的表达水平；Western blot检测糖酵解途径相关分子AMPK（p-AMPK）、mTOR(p-mTOR)、STAT3(p-STAT3)、HK2的蛋白表达水平；AMPK激动剂AICAR及抑制剂Compound C处理过表达及敲低UCA1的膀胱癌细胞；CCK8实验检测细胞活力；RT-PCR检测UCA1及自噬标志分子LC3、ATGs的mRNA表达水平；Western blot检测LC3、ATGs、p-AMPK、p-mTOR、HK2的蛋白表达水平。 研究结果： 1）在过表达UCA1的膀胱癌细胞UMUC2中发现，自噬标志物LC3和ATGs的mRNA及蛋白表达下调，自噬体（自噬溶酶体）计数减少；反之，在敲低UCA1的膀胱癌细胞5637中发现，[在敲低UCA1的膀胱癌细胞5637中发现，]自噬标志物LC3和ATGs的mRNA及蛋白表达上调，自噬体（自噬溶酶体）计数升高。过表达UCA1可抑制UMUC2细胞的自噬，而敲低UCA1则促进5637细胞自噬。表明UCA1参与膀胱癌的自噬过程。 [过表达UCA1可抑制UMUC2细胞的自噬，而敲低UCA1则促进5637细胞自噬。表 明UCA1参与膀胱癌的自噬过程。2）在过表达UCA1的膀胱癌细胞UMUC2中发现，ROS表达水平减低，ATP水平升高，糖酵解途径相关分子AMPK、mTOR、STAT3总蛋白水平无显著变化，而p-AMPK蛋白表达下调，p-mTOR、p-STAT3及HK2 蛋白表达均上调，自噬标志物LC3、ATGs表达下调。反之，在敲低UCA1的膀胱癌细胞5637中发现，ROS表达水平升高，ATP水平减低，糖酵解途径相关分子AMPK、mTOR、STAT3总蛋白水平无显著变化，而p-AMPK蛋白表达上调，p-mTOR、p-STAT3及HK2 蛋白表达均下调，自噬标志物LC3、ATGs表达上调。利用AMPK激动剂AICAR及抑制剂Compound C有效处理膀胱癌细胞后，上述结果得到进一步验证。表明UCA1通过糖酵解途径AMPK/mTOR/HK2抑制膀胱癌细胞UMUC2及5637自噬的发生。 结论： 1）过表达UCA1可抑制UCUM2细胞的自噬，而敲低UCA1则促进5637细胞自噬的。[过表达UCA1可抑制UMUC2细胞的自噬，而敲低UCA1则促进5637细胞自噬。 2）LncRNA-UCA1参与膀胱癌细胞自噬的过程是通过AMPK/mTOR/HK2途径实现的。[LncRNA-UCA1参与膀胱癌细胞自噬的过程是通过AMPK/mTOR/HK2途径实现的。

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UCA1 膀胱癌 长非编码RNA 糖酵解途径 自噬

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背景： 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，手术加化学药物是膀胱癌的标准治疗手段。虽然顺铂和吉西他滨是晚期膀胱癌的有效化疗药物，但是由于膀胱癌细胞化疗耐药致使治疗效果并不理想。膀胱癌细胞对顺铂和吉西他滨耐药的机制尚不清楚，近期有研究表明非编码RNAs可能参与肿瘤细胞的化疗耐药。 长非编码RNAs是一类长度大于200nt的不具有蛋白编码功能的转录本，能够结合蛋白质或RNA，调节蛋白质的定位和活性，在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因表达，与细胞增殖及凋亡过程密切相关，参与肿瘤细胞耐药。UCA1是在多种癌症细胞和组织中高表达的长非编码RNA，可作为原癌基因促进肿瘤的发生发展和化疗耐药。过表达UCA1不仅能增加膀胱癌和卵巢癌细胞对顺铂的耐药，促进乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药，还可以通过减少细胞凋亡降低结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性；敲低UCA1则能抑制胃癌细胞对阿霉素的化疗耐药。上述结果提示UCA1参与了肿瘤细胞耐药过程，但其是否参与膀胱癌细胞对吉西他滨耐药及其作用机制仍然不清楚。 目的： 证实UCA1参与膀胱癌细胞对顺铂和吉西他滨的耐药，探讨UCA1参与顺铂和吉西他滨耐药的分子机制，为临床提供潜在的肿瘤治疗靶点。 方法： 1. 将稳定敲低UCA1的膀胱癌5637细胞或稳定过表达UCA1的膀胱癌UMUC2细胞暴露于不同浓度的顺铂或吉西他滨后，采用CCK8、Annexin V/PI双染法和Western blot检测细胞活力、细胞凋亡百分比和凋亡相关蛋白的变化，观察UCA1是否参与膀胱癌细胞耐药。 2. 稳定敲低UCA1的5637细胞转染miR-196a-5p mimic或inhibitor后加入浓度依次升高的顺铂或吉西他滨，利用CCK8、Annexin V/PI双染法和Western blot检测细胞活力、细胞凋亡百分比和凋亡相关蛋白的变化，观察miR-196a-5p是否参与UCA1调控膀胱癌细胞耐药。 3. 利用pGL3.0-Basic Vector成功构建的包含miR-196a-5p上游启动子区4个CREB结合位点的重组质粒及突变质粒分别与pRL-TK共转染5637细胞，进行双荧光素报告酶实验。结合靶向CREB的siRNA检测敲低CREB后miR-196a-5p的改变，探讨UCA1调控膀胱癌细胞耐药的机制。 4. 利用pMIR-REPORT Luciferase成功构建的p27Kip1-WT 3’UTR表达载体和p27Kip1-Mut 3’UTR表达载体分别和miR-196a-5p mimic或mimic NC共转染5637细胞，进行双荧光素报告酶实验。采用Real Time PCR、Western blot检测5637细胞转染miR-196a-5p mimic或inhibitor后p27Kip1的变化，验证p27Kip1与miR-196a-5p的直接靶向关系。 5. 通过皮下注射5×106个5637细胞建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，成瘤后根据体积分为5组，连续3w分别注射生理盐水、p-RNA-shUCA1质粒或p-RNA-NC质粒和脂质体预混复合物及顺铂或吉西他滨，持续监测裸鼠体重及移植瘤生长情况。处死裸鼠后测量肿瘤体积，利用TUNEL和IHC检测细胞凋亡和相关蛋白的表达，体内验证UCA1调控膀胱癌细胞耐药的机制。在人膀胱癌组织中利用IHC、Real Time PCR检测CREB、p-CREB、UCA1和miR-196a-5p的表达情况并计算相关性。 结果： 1. 与对照组5637C细胞相比较，稳定敲低UCA1的5637sh-UCA1细胞中顺铂或吉西他滨诱导的膀胱癌细胞凋亡百分比显著增加，cleaved-caspase-3的蛋白表达水平升高，细胞活力和IC50值明显降低。稳定过表达UCA1的UMUC-2-UCA1细胞相对于对照组UMUC2-pcDNA3.1细胞中顺铂或吉西他滨诱导的膀胱癌细胞凋亡百分比显著减少，cleaved-caspase-3的蛋白表达水平下降，细胞活力和IC50值明显升高，表明UCA1能促进膀胱癌细胞对顺铂/吉西他滨的耐药。 2. 与5637C细胞转染miR-196a-5p inhibitor NC的对照组相比较，5637C细胞转染miR-196a-5p inhibitor实验组中顺铂或吉西他滨引起的膀胱癌细胞凋亡百分比显著增加，cleaved-caspase-3的蛋白表达水平升高，细胞活力和IC50值明显下降。5637sh-UCA1细胞中增加miR-196a-5p的表达能部分逆转敲低UCA1引起的顺铂或吉西他滨诱导的膀胱癌细胞凋亡百分比和cleaved-caspase-3蛋白表达水平的显著增加以及细胞活力和IC50值的明显下降，说明miR-196a-5p能够参与UCA1促进膀胱癌细胞对顺铂或吉西他滨的耐药。 3. 敲低UCA1能减少p-AKT和p-CREB的蛋白表达，过表达UCA1能增加p-AKT和p-CREB的蛋白表达，但总的AKT和CREB的蛋白表达没有发生改变。miR-196a-5p启动子区CREB结合位点突变能显著降低荧光素酶活性，敲低CREB后不仅miR-196a-5p的表达水平明显下降，而且UCA1依赖的miR-196a-5p的启动子区荧光素酶活性也显著降低，提示UCA1能通过p-AKT激活CREB 进而上调miR-196a-5p的表达。 4. p27Kip1 3’UTR野生型表达载体和miR-196a-5p mimic共转染能显著降低荧光素酶活性，而p27Kip1 3’UTR突变型表达载体和miR-196a-5p mimic共转染后荧光素酶活性基本不变。敲低miR-196a-5p能明显增加p27Kip1的mRNA和蛋白水平表达，过表达miR-196a-5p能显著降低p27Kip1的mRNA和蛋白水平，而且敲低CREB后，p27Kip1的mRNA和蛋白表达明显增加，表明p27Kip1是miR-196a-5p的直接靶点。5637C和5637 sh-UCA1细胞加入顺铂或吉西他滨后p27Kip1的mRNA和蛋白水平显著上调，提示p27Kip1是顺铂或吉西他滨的效应分子。 5. 裸鼠皮下成瘤后各处理组之间裸鼠体重无明显差别，加药后肿瘤体积出现差异。裸鼠处死后可见空白对照组肿瘤体积明显大于加药组，而且顺铂或吉西他滨联合敲低UCA1处理组肿瘤体积明显小于单独使用顺铂或吉西他滨组。TUNEL和免疫组化结果显示与空白对照组和单独使用顺铂或吉西他滨组相比较，顺铂或吉西他滨联合敲低UCA1处理组肿瘤细胞凋亡比例和cleaved-caspase-3的蛋白表达水平明显增加，p-AKT和p-CREB蛋白水平表达下降，p27Kip1蛋白表达增加，但总的AKT和CREB蛋白表达没有发生改变。实时定量结果显示UCA1敲低后miR-196a-5p表达显著下调，p27Kip1表达上调，这与体外实验结果一致。人膀胱癌组织总CREB、p-CREB、UCA1和miR-196a-5p的表达均高于膀胱癌旁组织，p-CREB的得分越高，UCA1和miR-196a-5p的表达越高，而且p-CREB与UCA1和miR-196a-5p的表达均呈正相关，但总CREB的得分与UCA1和miR-196a-5p的表达均无相关性。 结论： 1. UCA1能降低顺铂或吉西他滨诱导的膀胱癌细胞凋亡率，促进膀胱癌细胞耐药。 2. miR-196a-5p能够参与UCA1促进膀胱癌细胞对顺铂或吉西他滨的耐药。 3. UCA1通过p-AKT激活CREB进而调节miR-196a-5p的表达，p27Kip1是miR-196a-5p的直接靶分子。 4. 体内实验和临床组织样本验证了UCA1能够通过CREB/miR-196a-5p/p27Kip1通路促进膀胱癌细胞对顺铂/吉西他滨的耐药。

Keyword ：

CREB miR-196a-5p UCA1 膀胱癌 耐药

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