Abstract ：

摘 要 研究背景： 脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种外科常见的致残、致死性疾病，同时损伤局部的组织构造和生理功能具有其独特性，使得目前创伤后临床治疗的功能恢复十分困难，患者和社会也因此承受巨大的压力。脊髓损伤后，由于局部微环境的异常，导致多种神经生长抑制性因子表达于细胞表面，促进脊髓内源性神经干/祖细胞向星形胶质细胞分化，形成胶质瘢痕；分泌轴突再生抑制因子，抑制神经细胞和轴突的再生[1]。目前，脊髓损伤后的生物学治疗的研究主要集中于以下几个方面：(1)细胞移植；(2)分子生物学方法去除轴突再生抑制因素；(3)运用神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）。在细胞移植领域，由于神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）有多向分化潜能，具有细胞替代，分泌NGF以保护残存神经细胞及促进功能细胞和轴突生长的作用，是目前最有前景的移植细胞[2]。但是，众多的动物体内实验发现，脊髓损伤后，由于炎症反应、免疫调节等众多复杂因素的影响，导致脊髓内源性的神经干细胞和移植的外源性的NSCs大部分分化为星形胶质细胞，形成胶质瘢痕，分泌轴突再生抑制因子，阻碍轴突的再生。因此，研究NSCs增殖与分化调控的分子机制，对脊髓损伤的治疗及NSCs移植促进损伤恢复意义重大。 NSCs增殖与分化的分子调控机制十分复杂，受到多条途径的共同作用。其中Notch 信号通路在神经系统的发生和发育上起着重要的作用[3]。综合国内外对Notch通路对神经干细胞的调控的研究现状，Notch信号通路激活可以促进胚胎时期侧脑室下区来源的NSCs增殖。然而，NSCs在胚胎和成年阶段的生物学特征是否相同目前尚不十分清楚，同时，Notch信号通路对成年脊髓神经干/祖细胞（Neural Stem and Progenitor Cells，NSPCs）增殖分化的影响在国内外尚属空白。 本实验将就Notch 信号通路对成年小鼠脊髓来源的神经干/祖细胞增殖的调控作用进行观察，探讨其对神经干/祖细胞的影响，并对其调控机制进行研究。 研究目的： 1. 建立NSPCs体外培养体系； 2. 构建Notch1失活的NSPCs(EGFP-EC-mNotch1-NSPCs)和Notch1过表达的NSPCs (EGFP-IC-mNotch1-NSPCs)细胞模型； 3. 观察Notch信号通路对NSPCs 增殖的影响； 4. 探讨Notch信号通路影响NSPCs增殖的机制。 研究方法： 分离培养成年C57BL/6J小鼠脊髓来源的NSPCs并进行鉴定。构建pLGFP-WT-mNotch1（野生型 Notch1受体）， pLEGFP-EC-Notch1（Notch1失活受体）和 pLEGFP-IC-Notch1（Notch1过表达受体）三种重组逆转录病毒基因表达载体，并转染NSPCs进行目标基因表达稳定克隆筛选，以获得对照组野生型Notch1受体的NSPCs (EGFP-WT-NSPCs)、Notch1失活的 NSPCs及Notch1过表达的NSPCs。体外实验应用蛋白免疫印迹法（Western blotting）和实时定量PCR（qPCR）验证3组NSPCs细胞模型构建成功，并应用CCK-8法和Brdu标记法观测细胞增殖能力的不同；观察细胞周期改变并筛选出相关细胞周期蛋白。 研究结果及讨论： 1. NSPCs分离培养及鉴定 成功分离培养成年小鼠脊髓来源的神经干/祖细胞，培养的神经干/祖细胞3天后形成神经球并表达Nestin阳性。7天后诱导分化为神经元(β-tubulin阳性)，星形胶质细胞(GFAP阳性)及少突胶质细胞(O4阳性)。以上结果表明本实验中NSPCs的体外培养体系稳定。 2. 逆转录病毒载体转染NSPCs 构建三种NSPCs细胞模型，并通过Western blotting验证，我们发现Notch1过表达的NSPCs在蛋白质水平上导致了6倍的增长，而Notch1失活的NSPCs与对照组野生型NSPCs基本相同。Notch 1胞内段下游的Hes 1和Hes 5在Notch1过表达的NSPCs上调，而在Notch1失活的NSPCs下调。应用qPCR证实了Notch受体下游基因mRNA的表达有同样的趋势，表明本次实验三种细胞模型构建成功。 3. Notch 1过表达对NSPCs增殖的调控作用 应用CCK-8检测Notch1过表达的NSPCs和Notch1失活的NSPCs的代谢能力，并用Brdu分析两种细胞DNA的复制能力。相较于对照组，Notch1过表达的NSPCs的Brdu的细胞阳性率从37.23%增加到61.66%，Notch1失活的NSPCs的Brdu的阳性率从37.23%减少到25.27% （P<0.05）。CCK-8结果显示Notch1过表达的NSPCs的增殖能力增加（P<0.05），提示Notch1过表达对NSPCs的增殖起促进作用。 4. Notch1过表达改变细胞周期的进程 通过流式细胞仪分析了三组NSPCs的细胞周期改变，观察到Notch1过表达的NSPCs有44.68%的细胞从 G1期进入S期。相反，在Notch1失活的NSPCs只有11.03%的细胞进入S期，表明Notch1过表达导致处于S期NSPCs数量增加。 5. Notch1过表达的影响NSPCs细胞周期蛋白D1(Cyclin D1）的表达 从G1到S期的细胞，Cyclin D1表达水平升高。与对照组相比，Notch1过表达的NSPCs的Cyclin D1表达量升高，而Notch1失活的NSPCs的表达量下降。qPCR对mRNA表达的分析结果也证实了这一变化。这些结果提示Notch1过表达上调NSPCs Cyclin D1的表达。 研究结论： 1. Notch 1受体过表达可以促进成年小鼠NSPCs的增殖； 2. Notch 1信号通路的过表达上调了细胞周期调节剂cyclin D1； 3. 增加的细胞周期蛋白D1促进成年小鼠NSPCs由G1期向S期过度，从而导致增殖增加。

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Notch信号通路 脊髓损伤 神经干/祖细胞 细胞周期

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目的:建立BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型,为研究白血病的发病机制和药物开发提供理想的平台.方法:利用含有pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆转录病毒上清感染6~10周龄C57BL/6供者小鼠的骨髓细胞,移植给致死量射线照射的同种同型受者小鼠,建立BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型;监测移植小鼠的体质量,生存率;流式细胞仪检测小鼠外周血有核细胞GFP表达(代表有核细胞表达BCR/ABL1)和细胞分型;观察小鼠脾脏、肺脏和肝脏等器官大体形态和HE染色变化.结果:移植20 d后,移植小鼠呈现弓背、活动性减少、精神萎靡的状态,体质量明显降低;流式细胞仪检测外周血中出现GFP+细胞,并且随着移植时间的延长,GFP+粒细胞明显增多.移植小鼠的生存率较对照组明显降低.移植小鼠发病后呈现脾脏显著增大、肺出血、肺脏及肝脏出现白色结节和HE染色呈现大量细胞浸润,且小鼠脾脏中有核细胞的80%为GFP+Gr-1+细胞,即BCR-ABL1+粒细胞白血病细胞.结论:利用此方法成功建立了BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型,为研究慢性粒细胞白血病机制和治疗提供了平台.

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BCR-ABL1 BCR-ABL1+粒细胞白血病 逆转录病毒载体 生存率 小鼠

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BCR-ABL1 BCR-ABL1+粒细胞白血病 逆转录病毒载体 生存率 小鼠

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背景：肿瘤的基因治疗，是将外源性基因设法导入细胞中并有效表达，以治愈或改善肿瘤预后的方法。使外源性基因完整地进入细胞需要载体。目前，慢转录病毒载体作为改良后的逆转录病毒载体，具有容量大、可感染分裂期和非分裂期的细胞、在宿主细胞中稳定表达的优点，是当今肿瘤基因治疗中的一种被广泛应用的载体。为确保其安全性，本课题选择缺氧和端粒酶两个实体瘤特有的靶点，调节目的基因的表达。实体瘤中都存在慢性缺氧的微环境，细胞内缺氧诱导因子（HIF-1）的水平会显著升高，并作为转录激活因子上调缺氧反应相关蛋白的表达。HIF-1的转录激活作用是通过结合在这些基因5’端上游的缺氧反应元件（HRE）区实现的。在不同基因的启动子中，HRE具有相当高的同源性，且其重复的次数也没有基因特异性，集中在5~9次。因此，在实体瘤的基因治疗中，可以利用肿瘤的缺氧微环境，使用HRE作为靶点。在几乎所有肿瘤细胞中，都出现了一种新的反转录酶——端粒酶，在染色体末端进行逆转录反应，延续端粒序列。端粒酶是由RNA模板（TERC）和端粒酶催化亚单位（TERT）组成的。其中，TERC在正常细胞中即可检出，而TERT只在肿瘤细胞中存在。hTERTp在肿瘤细胞中的普遍高活性和在正常细胞中的低活性或无活性，使其成为了肿瘤细胞的又一理想靶点。尾型同源盒基因2（CDX2）是肠特异性转录因子的一种。在胚胎发育过程的早期就出现，决定器官发生和肠上皮分化。在成人，CDX2仅在肠道上皮中特异性表达，在肠上皮细胞分化中起着重要作用。CDX2的表达缺失几乎在所有结直肠腺癌中都可发现。结直肠癌的发病率和死亡率在全世界范围内都排在前列，但其主要的治疗方式仍以传统的外科治疗和放、化疗为主。在肿瘤基因治疗高速发展的今天，我们拟用诱导肿瘤细胞分化的方法，构建向结直肠癌细胞中导入CDX2基因的载体。在靶向性及安全性方面，我们选择5个拷贝的HRE序列和作为启动子的hTERTp，利用肿瘤细胞缺氧和端粒酶活性高的特性，靶向性启动CDX2的表达，与正常细胞区别开来。目的：构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控，表达CDX2基因的慢病毒表达载体，并在结肠癌LoVo细胞中进行功能验证。方法：选用慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG。（1）在Genbank上查找hTERTp序列，设计PCR引物（含HindIII 和PstI酶切位点），从人结肠癌标本中提取目的片段hTERTp，构建pLEGFP-hTERTp，将本课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp应用HindIII 和PstI双酶切，hTERTp连入线性化的pLEGFP-5HRE-CEAp，构建pLEGFP-5HRE-hTERTp；（2）以pLEGFP-5HRE-hTERTp为模板，设计PCR引物（含MluI和XhoI酶切位点），提取5HRE-hTERTp基因序列，同时通过MluI和XhoI双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体上的CMV启动子使pLVX-EGFP-3FLAG线性化，同源重组构建pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体；（3）以本课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体为模板，设计PCR引物（含EcoRI和BamHI酶切位点），提取CDX2基因序列，同时通过EcoRI和BamHI双酶切切除pLVX-5HRE-hTERTp- EGFP-3FLAG载体上的EGFP使其线性化，同源重组构建pLVX-5HRE-hTERTp- CDX2-3FLAG载体；（4）应用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞，通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达，鉴定hTERTp的转录活性；（5）应用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体及pLVX-5HRE-hTERTp- CDX2-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞，免疫组化观察FLAG蛋白的表达鉴定此载体的表达情况。结果：经PCR和测序分析，pLEGFP-5HRE-hTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP- 3FLAG、pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG三组质粒与设计一致，测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞，有绿色荧光表达，说明hTERT启动子存在转录活性。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP- 3FLAG载体及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞，通过免疫组化发现均有标签抗原FLAG表达，hTERT启动子可以启动下游基因表达。结论：成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体，为后续的体外和体内实验奠定了基础。但其双靶向调控功能仍需进一步实验证明。

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缺氧端粒酶肿瘤基因治疗慢病毒载体结直肠癌

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缺血性卒中是临床上常见的严重危害人类健康的疾病之一，具有致死率和致残率高等特点。目前，针对缺血性卒中的治疗主要聚焦于血管再通和神经保护，但实际上只有很少一部分患者能够在急性期时间窗内接受血管再通的治疗。神经营养因子-3（neurotrophin-3, NT-3）是一种具有多功能的神经营养因子，除了具有维持神经元存活、诱导神经元分化和促进神经损伤修复的传统的神经保护作用外，其还与血管发生密切相关，是治疗缺血性卒中的理想选择之一。由于NT-3不能通过血脑屏障，所以只能局部注射给药。但是单次经脑室或实质内注射不能产生有效剂量，而多次注射或者借助于侵袭性微管装置来注射易引起损伤，使其临床使用受到限制。采用基因表达载体将NT-3导入脑组织或脑血管中，通过其在局部的表达可以对脑组织产生神经保护作用。但是外源基因在脑内过表达可能会引起癫痫和肿瘤等不良反应，因此，构建靶向性和可控性的基因载体对解决基因治疗的安全性非常重要。缺氧是存在于多种疾病的病理生理过程，包括缺血性卒中。在多种组织出现缺氧时，缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor 1, HIF-1）与缺氧反应元件（hypoxia responsive element, HRE）相互作用，可以诱导一系列缺氧相关基因表达，如促红细胞生成素和血管内皮生长因子。HIF-1分为HIF-1α和HIF-1β两个亚基，常氧条件下通过PHDs的泛素化作用HIF-1α迅速降解；缺氧时HIF-1α表达升高，稳定性增强，进而入核与HIF-1β结合形成具有转录活性的HIF-1转录复合体，该二聚体可以与缺氧相关基因的启动子区域的HRE发生特异性结合，进而启动缺氧相关基因的转录，介导机体对缺氧的反应。利用缺氧条件下HIF-1与HRE特异性结合机制，有研究发现将5个拷贝的血管内皮生长因子来源的HRE（5HRE）作为调控元件，在缺氧条件下其可以有效地驱动下游基因高效表达。研究表明脑缺血后局部组织存在缺氧微环境，在此HIF-1α表达上调，鉴于缺血性卒中的此特性，我们将5个拷贝的人血管内皮生长因子来源的HRE与猴空泡病毒40最小启动子（simian virus 40 minimal promoter, SV40mp）连接组成缺氧调控序列，与NT-3序列融合后构建成重组逆转录病毒载体，在体外培养的PC12细胞和大鼠局灶性脑缺血模型中观察5HRE对目的基因NT-3表达的缺氧/缺血靶向性调控作用，以及5HRE-NT3转导对缺氧/缺血诱导的损伤的神经保护作用。研究目的：1. 构建含有5HRE的缺氧调控的NT-3表达载体，通过体内、外实验研究5HRE对NT-3表达的缺氧/缺血反应性调控。2. 观察缺氧反应性调控的NT-3表达对缺氧诱导的细胞凋亡的影响以及对大鼠局灶性脑缺血引起的脑损伤的神经保护作用。研究方法：1. 用PCR、酶切和连接等分子克隆技术将5HRE、SV40mp、人来源NT-3和增强绿荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）片段分别克隆入逆转录病毒载体pLNCX中，构建重组逆转录病毒穿梭质粒pLNCX- 5HRE-SV40-NT3-IRES-EGFP。经PT67包装细胞包装、高速离心纯化和浓缩等方法，获得逆转录病毒RV-5HRE-NT3。用逆转录病毒感染NIH 3T3细胞48 h后，流式细胞仪检测并计算出病毒滴度。2. 用逆转录病毒感染PC12细胞，经过G418抗生素筛选，获得稳定表达5HRE-NT3的细胞PC12-5HRE-NT3，并分别用反转录PCR（reversed transcription PCR, RT-PCR）和免疫细胞荧光染色的方法检测外源基因SV40mp、NT-3、EGFP的mRNA和NT-3蛋白表达情况。3. 将PC12细胞培养于0.3% O2、5% CO2和94.7% N2的环境中，处理48 h制作缺氧诱导PC12细胞损伤模型。Western blot方法检测缺氧3、6、12、24和48 h后PC12细胞中HIF-1α蛋白的表达变化。4. 将PC12-5HRE-NT3和PC12-NT3分别给予常氧和缺氧处理，采用RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测细胞内NT-3 mRNA和蛋白以及细胞培养上清中NT-3蛋白的表达和分泌情况，在体外观察缺氧条件下5HRE对NT-3表达的调控，同时用TUNEL染色研究5HRE-NT3或5HRE-EGFP基因转导对缺氧诱导的PC12细胞凋亡的影响，Western blot方法检测并分析p38和caspase-3的激活水平变化。5. 借助脑立体定位仪将逆转录病毒（RV-5HRE-NT3、RV-5HRE-EGFP）或生理盐水注射入大鼠脑实质，3 d后用大脑中动脉线栓阻塞法（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。6. tMCAO后第1、7和14 d用免疫组织化学染色法观察缺血损伤后大鼠脑内HIF-1α的表达变化情况；tMCAO后第1、3、7和14 d用Western blot法检测在体5HRE对NT-3表达调控作用；tMCAO后第3 d用TTC染色法观察RV-5HRE-NT3注射对大鼠tMCAO后脑梗死体积百分比的影响；tMCAO后第3和7 d用TUNEL染色法检测RV-5HRE-NT3注射对大鼠tMCAO后细胞凋亡的影响；在tMCAO前1 d以及tMCAO后第1、3、5、7、14和28 d用Reglodi评分法检测RV-5HRE-NT3注射对大鼠tMCAO后神经功能损伤的影响。实验结果：1. 成功构建了以5HRE为缺氧调控元件、SV40mp为启动子、NT-3为治疗基因、EGFP为报告基因的重组逆转录病毒载体质粒（pLNCX-5HRE-SV40-NT3-IRES-EGFP），并获得相应的逆转录病毒（RV-5HRE-NT3）；将病毒感染PC12细胞并经过G418抗生素筛选后获得5HRE-NT3基因修饰的PC12细胞（PC12-5HRE-NT3）。2. 与常氧培养组相比，缺氧处理12 h后，PC12细胞内HIF-1α蛋白表达显著升高，24 h达高峰。3. 在常氧条件下，有5HRE调控的PC12-5HRE-NT3中NT-3的mRNA和蛋白表达水平明显低于无5HRE调控的PC12-NT3组；在有5HRE调控的PC12-5HRE-NT3中，与常氧组相比，缺氧条件下NT-3的mRNA和蛋白表达水平明显升高；在无5HRE调控的PC12-NT3中，与常氧组相比，缺氧条件下NT-3的mRNA和蛋白表达下降。细胞培养上清中NT-3分泌情况检测结果同上，在有5HRE调控的PC12-5HRE-NT3中，与常氧组相比，缺氧处理后细胞培养上清中NT-3含量升高了约9.6倍；在无5HRE调控的PC12-NT3培养上清中，与常氧组相比，缺氧处理后NT-3的含量无明显变化。4. 与PC12细胞缺氧组相比，PC12-5HRE-NT3缺氧组的凋亡细胞百分明显减少，P-p38/p38比值和活化的caspase-3蛋白水平下调。5. 在正常大鼠脑内未检测到HIF-1α表达，大鼠tMCAO 1 d后在位于缺血半暗带的胼胝体和纹状体中均有大量HIF-1α阳性细胞，在第7和14 d仍有HIF-1α表达。6. 大鼠tMCAO 3 d后RV-5HRE-NT3组中NT-3阳性细胞数明显多于生理盐水和RV-5HRE-EGFP对照组，且着色较深；Western blot分析显示，tMCAO后第1、3、7和14 d，RV-5HRE-NT3组中的NT-3蛋白表达均明显高于生理盐水和RV-5HRE-EGFP对照组。7. 与生理盐水或RV-5HRE-EGFP对照组相比，RV-5HRE-NT3注射明显减小tMCAO 3 d后大鼠脑梗死体积百分比，明显减少tMCAO 3和7 d后缺血半暗带凋亡细胞百分比。RV-5HRE-NT3组大鼠的Reglodi神经功能学评分明显低于生理盐水或RV-5HRE-EGFP对照组，提示RV-5HRE-NT3注射可以改善大鼠tMCAO后的神经功能障碍。结论：1. 在5HRE-NT3缺氧调控表达系统中，常氧条件下NT-3仅有少量表达。在5HRE介导的缺氧调控下，缺氧/缺血后NT-3的表达明显上调。2. 5HRE-NT3基因转导可以减少缺氧诱导的PC12细胞凋亡，可能与p38和caspase-3通路有关。3. 5HRE-NT3缺氧调控表达系统转导入大鼠脑后，5HRE介导的NT-3缺氧反应性表达上调可以减轻局灶性脑缺血引起的脑损伤。体内、外研究结果提示缺氧调控的基因表达系统可以为中枢神经系统缺血/缺氧相关疾病的基因治疗提供一种有效的工具。

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神经营养因子-3缺氧反应元件逆转录病毒脑缺血神经保护

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Abstract ：

目的 包装出携5拷贝缺氧反应元件(5HRE)增强子和癌胚抗原启动子(CEAp)联合调控的超抗原中毒性休克综合征毒素-1 (TSST-1)基因的逆转录病毒,并建立稳定表达TSST-1的人结肠癌Lovo细胞株.方法 应用已构建好的逆转录病毒载体pLEGFP N1 5HRE-CEAp TSST-1 linker-CD80TM,与辅助质粒pMB-MLV、pMB-G共转染入293T细胞,LaSRT法检测病毒滴度.包装出的逆转录病毒感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo和CEA阴性的人宫颈癌细胞株Hela.应用RT-PCR和免疫组化方法鉴定TSST-1的表达.结果 获得重组逆转录病毒滴度约为1×106 CFU/mL.RT-PCR及免疫组化证实经病毒感染的Lovo细胞在mRNA和蛋白水平均有TSST-1表达,缺氧环境中的mRNA表达量更高,且细胞传代20次后依然有TSST-lmRNA表达；经病毒感染的Hela细胞在常氧或缺氧状态下均无TSST-1mRNA及蛋白表达.结论 包装出较高滴度重组逆转录病毒,并能靶向性在CEA阳性肿瘤内稳定表达TSST-1,为后续检验TSST-1对肿瘤的杀伤效应奠定了基础.

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CEA阳性肿瘤 超抗原 免疫基因治疗 逆转录病毒 缺氧诱导

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Abstract ：

目的:研究缺氧微环境对靶向性表达的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1)激活人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)对CEA+结肠癌LoVo细胞杀伤作用的调控.方法:包装、收集前期构建的缺氧反应元件( hypoxia-response elements,HRE)和癌胚抗原启动子CEAp联合调控的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM(简称pLEGFP-N1-5HCTC),感染CEA+ LoVo细胞及CEA -宫颈癌HeLa细胞,获取稳定表达跨膜型超抗原TSST-1-linker-CD80TM蛋白(TC融合蛋白)的肿瘤细胞.用缺氧模拟试剂CoCl2模拟缺氧微环境,RT-PCR和Western blotting分别检测缺氧调控下TSST-1的表达水平.将健康人PBL与pLEGFP-N1-5 HCTC感染后的肿瘤细胞共培养,3H-TdR掺入法检测缺氧调控下PBL的增殖能力,MTT法检测缺氧调控下PBL对肿瘤细胞的杀伤效应.结果:pLEGFP-N1-5HCTC病毒成功感染CEA+LoVo细胞(5HCTC/LoVo),RT-PCR和Westernblotting证实,缺氧可上调5HCTC/LoVo细胞中TSST-1mRNA和蛋白的表达,CEA - HeLa细胞在常氧和缺氧条件下均无TSST-1的表达.缺氧可上调5HCTC/LoVo细胞诱导的人PBL的增殖(7.3×103 vs 3.1×103cpm,P＜0.05),缺氧环境下PBL对5HCTC/LoVo细胞的杀伤率明显高于常氧环境(82.69％vs 53.50％,P＜0.01)；CEA - HeLa细胞不能刺激PBL增殖,PBL对其也无抑制作用.结论:缺氧微环境可显著上调靶向性表达的超抗原TSST-1诱导的对CEA+ LoVo细胞的杀伤作用.

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CEA+结肠癌细胞 HeLa细胞 LoVo细胞 逆转录病毒 缺氧微环境 外周血淋巴细胞 中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)

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背景：CEA阳性肿瘤是一类发病率很高且严重危害人类健康的疾病，现有的常规治疗方法疗效不理想，预后差，CEA阳性肿瘤死亡人数占癌症总死亡人数50%以上。恶性肿瘤的发生是一个复杂的受多因素的影响和多个基因调控的过程。虽然采用手术治疗结合放化疗以及生物治疗等多种治疗手段的综合治疗模式，使CEA阳性肿瘤患者的预后有所改善，但总体疗效仍不能令人满意。近年来，随着肿瘤免疫学和分子生物学的研究不断取得新突破，新的治疗手段如免疫治疗和基因治疗等成为CEA阳性肿瘤治疗研究的新热点。目的：包装出携5拷贝缺氧反应元件（5HRE）增强子和癌胚抗原启动子（CEAp）联合调控超抗原中毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）基因的逆转录病毒并建立稳定表达TSST-1的人结肠癌LoVo细胞株，并检测CEAp启动子与5HRE增强子的活性。方法：应用已构建好的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1–linker -CD80TM,与辅助质粒pMB-MLV、pMB-G共转染入293T细胞，包装出重组逆转录病毒，LaSRT法检测病毒滴度。包装出的逆转录病毒感染CEA阳性的人结肠癌细胞株LoVo和CEA阴性的人宫颈癌细胞株Hela。应用RT-PCR和免疫组化方法鉴定TSST-1表达。在缺氧和常氧条件下，检测LoVo细胞TSST-1的mRNA表达差异。结果：获得重组逆转录病毒滴度约为1×106cfu/ml。RT-PCR及免疫组化证实经病毒感染LoVo细胞在mRNA和蛋白水平均有TSST-1表达，缺氧环境中的mRNA表达量更高，且细胞传代20次后依然有TSST-1mRNA表达；经病毒感染Hela细胞在常氧或缺氧状态下均无TSST-1mRNA及蛋白表达。结论：包装出较高滴度重组逆转录病毒，并能靶向性在CEA阳性肿瘤内稳定表达TSST-1，为后续检验TSST-1对肿瘤杀伤效应奠定基础。

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逆转录病毒超抗原CEA阳性肿瘤免疫基因治疗

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目的 构建假型逆转录病毒载体MuLV/VSV-G,并用于转染兔平滑肌细胞,为兔平滑肌细胞基因转染寻找一种高效的载体.方法 构建含有报道基因lacZ的假型逆转录病毒载体MuLV/VSV-G,测定滴度,并转染兔平滑肌细胞,观察其转导效率.并与MuLV的转导效率进行比较.结果 构建的MuLV/VSV-G载体,病毒滴度为6～7.8×10~6CFU,转染兔平滑肌细胞的效率是(92±12)%.而MuLV的转导效率为(24±5)%.结论 成功构建了假型逆转录病毒载体MuLV/VSV-G载体,该载体作为一种高效的载体可用于兔平滑肌细胞基因转染.

Keyword ：

假型逆转录病毒载体 平滑肌细胞 转染

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目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的趋化因子受体4(CXCR4)的短发夹RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体,并研究其对hTERT阳性膀胱癌细胞中CXCR4表达的抑制效应及对细胞侵袭、增殖的影响.方法 用PCR扩增特异CXCR4-shRNA的DNA片段,以hTERT启动子代替U6启动子,将重组基因片段导入到逆转录病毒载体,收获病毒后分别感染膀胱癌细胞BIU87及人胚肺成纤维细胞MRC5和人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR、Western blot检测CXCR4 mRNA及蛋白的表达.MTT法检测细胞增殖变化.TransweU小室实验检测细胞体外侵袭能力的变化.结果 hTERTpro-CXCR4.shRNA能显著抑制MCF7、BIU87细胞CXCR4 mRNA及蛋白的表达,48h mRNA抑制率分别为(87.09±7.60)%、(91.02±11.32)%,48h蛋白抑制率分别为(89.014±4.87)%、(90.424±9.64)%,其对MRC5细胞不抑制.感染重组病毒的膀胱癌细胞体外侵袭、增殖能力均显著下降.结论 重组病毒中hTERT启动子调控的下游RNA干扰序列可靶向表达于hTERT阳性膀胱癌细胞、乳腺癌细胞,不表达于hTERT阴性MRC5细胞.

Keyword ：

膀胱肿瘤 短发夹RNA 逆转录病毒 人端粒酶逆转录酶

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