Abstract ：

目的测定羟基酪醇丁酸酯(HT-Bu)表观油水分配系数,考察HT-Bu在不同pH缓冲液中的溶解性能和溶解趋势,并进行稳定性研究,为制剂设计提供理论依据。方法对外观和溶解性等进行考察,建立高效液相色谱含量测定方法;采用摇瓶法测定油水(O/W)分配系数和化合物在不同pH值缓冲溶液中的溶解性。结果HT-Bu为淡黄色黏稠油状液体,无臭无味,浓度在5~50μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9998);O/W分配系数LgP为1.0;HT-Bu的乙腈-水(60∶40,V/V)溶液室温放置12 h比较稳定;在pH为2.0~9.0的磷酸盐缓冲溶液中,HT-Bu溶解度随pH增大,先升高后降低;在pH为5.5条件下很不稳定,6 h后药物含量下降较多;在pH为8.0条件下较稳定,12 h后含量少部分下降;在pH为7.4条件下稳定,12 h含量无明显变化。结论HT-Bu的水溶性良好,在酸性和碱性环境下不稳定。

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处方前研究 高效液相色谱法 羟基酪醇丁酸酯 油水分配系数

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建立了测定橄榄叶、细胞培养基和血液样品中羟基酪醇(HT)含量的超高效液相色谱方法,并对影响分离分析的色谱条件进行优化。0.04%甲酸水溶液为流动相A,0.04%甲酸甲醇溶液为流动相B,采用线性梯度洗脱模式,流速0.2 mL/min,检测波长200 nm的最佳分离条件下,10 min内可以实现样品中低浓度HT(0.85μmol/L,S/N=10)的检测。该方法回收率的96.8%~111.5%,相关系数r^2=0.9997。

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超高效液相色谱 橄榄叶 羟基酪醇 细胞培养基 血液

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目的测定羟基酪醇丁酸酯(HT-Bu)表观油水分配系数,考察HT-Bu在不同pH缓冲液中的溶解性能和溶解趋势,并进行稳定性研究,为制剂设计提供理论依据。方法对外观和溶解性等进行考察,建立高效液相色谱含量测定方法;采用摇瓶法测定油水(O/W)分配系数和化合物在不同pH值缓冲溶液中的溶解性。结果 HT-Bu为淡黄色黏稠油状液体,无臭无味,浓度在5～50μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9998);O/W分配系数LgP为1.0;HT-Bu的乙腈-水(60∶40,V/V)溶液室温放置12 h比较稳定;在pH为2.0～9.0的磷酸盐缓冲溶液中,HT-Bu溶解度随pH增大,先升高后降低;在pH为5.5条...

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处方前研究 高效液相色谱法 羟基酪醇丁酸酯 油水分配系数

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羟基酪醇醋酸酯在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用，能够对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用；能够降低主动脉内皮细胞内的基质金属蛋白酶‑1(MMP‑1)、细胞间黏附分子‑1(ICAM1)和血浆纤溶酶原激活物抑制剂‑1(PAI‑1)的mRNA水平含量，能够对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体起保护作用，通过抗炎和保护线粒体功能来预防动脉粥样硬化的发生和发展。

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研究背景： 高脂血症与心血管疾病的发生关系密切。我国高甘油三酯血症的发病率明显高于高胆固醇血症且呈上升趋势。甘油三酯(TG)水平升高通过引发氧化应激、炎症、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等病理过程，在心脑血管相关疾病、糖尿病及脂肪肝的发生发展过程中发挥了重要作用，预防与治疗高甘油三酯血症对于心脑血管相关疾病具有重要意义。由于心血管疾病病理机制复杂，涉及到炎症、氧化应激等多种因素，因此在降血脂治疗中，同时通过抗氧化等多靶标干预更具意义。 研究目的： 贝特类化合物是降低TG及极低密度脂蛋白(VLDL)的对症治疗药物，在降血脂及相关疾病的预防与治疗中具有重要作用。但长期使用存在肝毒性等副作用，临床上与他汀类药物合用时还会导致肌溶解等不良反应。作为PPARα激活剂，其不良反应可能与PPARα激活产生ROS有关。本研究通过将贝特酸与具有心血管保护作用的天然抗氧剂羟基酪醇进行分子杂合，制备羟基酪醇的贝特酸酯，对其降血脂、抗氧化和抗炎等药理活性及药物代谢动力学特征进行研究，以期得到不良反应少、且具有多重药理活性的降血脂活性化合物，为贝特类化合物的进一步开发提供实验依据。 研究内容及方法： 1. 羟基酪醇贝特酸酯的制备、毒性评价及其理化性质研究 (1) 羟基酪醇经溴化苄保护邻二酚羟基，分别与氯贝丁酸和非诺贝特酸在EDCI和DMAP作用下进行缩合，在H2/Pd-C作用下脱保护分别得化合物羟基酪醇氯贝丁酸酯(CA-HT)和羟基酪醇非诺贝特酸酯(FA-HT)。 (2) 采用半数致死剂量法评价CA-HT和FA-HT的急性毒性；正常小鼠灌胃给药，测定肝功能指标、抗氧化指标等对CA-HT和FA-HT的肝脏毒性进行评价。 (3) 采用紫外分光光度法测定CA-HT和FA-HT在不同pH值条件下的溶解度；采用HPLC法测定CA-HT和FA-HT的脂水分配系数。 2. CA-HT和FA-HT体外抗氧化、抗糖基化活性评价 (1) 通过对DPPH•和OH•自由基清除活性和抗脂质过氧化活性来评价CA-HT和FA-HT的抗氧化活性。 (2) 通过牛血清白蛋白(BSA)-丙酮醛(MGO)体系评价CA-HT和FA-HT的抗糖基化能力。 3. FA-HT的降血脂和降血糖活性研究 (1) 采用Triton WR 1339诱导急性高脂血症小鼠模型评价FA-HT的降血脂活性及其剂量依赖性关系。 (2) 采用高脂饲料诱导高脂大鼠模型，通过测定血脂水平、抗氧化指标、炎症因子和肝功能指标等，对FA-HT的降血脂和保肝活性进行评价。 (3) 采用STZ诱导的糖尿病小鼠模型评价FA-HT的降血糖活性及抗氧化活性。 (4) 采用高脂饲料联合小剂量STZ诱导糖尿病模型，通过测定血糖与血脂水平、抗氧化指标、炎症因子和肝功能指标等，对FA-HT的降血糖、降血脂及保肝活性进行综合评价。 4. FA-HT的药物代谢动力学研究 采用HPLC方法评价FA-HT的吸收、代谢和血浆蛋白结合率等相关参数。 (1) 采用单向灌流法研究FA-HT在大鼠肠道的吸收特征，并与FF、HT及等摩尔混合物FF+HT的吸收特征相比较。 (2) 采用体外孵育法研究肠内容物、肝匀浆、全血、血浆和血细胞对FA-HT的代谢作用。 (3) 大鼠灌胃给药FA-HT后，测定代谢产物FA与HT的血浆浓度变化，并比较FA-HT与FF、HT和等摩尔混合物FF+HT的药动学差异。 (4) 采用平衡透析法测定FA与HT的血浆蛋白结合率及其相互影响。 研究结果： 1. (1) 化合物CA-HT和FA-HT结构经1H-NMR、13C-NMR、HR-MS表征，结构正确，是未见文献报道的新化合物。 (2) 急性毒性实验结果显示，正常小鼠一次性灌胃给药，FA-HT在1280 mg/kg剂量时开始出现小鼠死亡，相当于正常给药剂量的78.0倍；CA-HT的LD50为2332 mg/kg，相当于正常给药剂量的24.8倍，组织形态学显示CA-HT损伤肝脏和肾脏；肝毒性实验结果显示，正常小鼠灌胃给药，FA-HT给药组小鼠肝功能指标AST、ALT和肝组织形态与Normal组小鼠没有明显差异，FA-HT未表现出肝毒性；而CA-HT与Normal组相比，肝功能指标AST和ALT分别升高13.17%(P<0.01)和9.66%(P<0.05)，肝组织出现炎症和细胞坏死，CA-HT表现出明显的肝毒性。 (3) 与CF相比，CA-HT在不同pH值条件下的溶解度均有不同程度的增大，CA-HT的脂水分配系数降低；与FF相比，FA-HT在不同pH值条件下的溶解度均有不同程度的增大，FA-HT的脂水分配系数减小。 2. (1) CA-HT和FA-HT具有明显的清除OH•和DPPH•自由基及抗脂质过氧化活性，均强于抗坏血酸，表现出明显的抗氧化活性。 (2) CA-HT和FA-HT在体外均有抗糖基化活性，CA-HT强于阳性药氨基胍。 3. (1) FA-HT对Triton WR 1339诱导的急性高脂模型小鼠的降血脂活性表现出剂量依赖性，剂量越大，降脂效果越强；FA-HT(0.036 mmol/kg)给药组高脂小鼠的TG和TC水平分别降低76.29%(P<0.01)和53.85%(P<0.01)，而FF(0.036 mmol/kg)给药组高脂小鼠的TG和TC水平分别降低20.70%(P<0.01)和9.78%(P>0.05)，FA-HT的降血脂活性优于FF。 (2) FA-HT对高脂饲料诱导慢性高脂大鼠能够显著降低TG、TC和LDL-C水平，抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX显著升高，脂质过氧化产物MDA显著降低，炎症因子TNF-α和CRP和肝功能指标AST、ALT、AKP和T-BIL含量明显降低，脂肪在肝脏的堆积显著减少；FA-HT在高脂模型大鼠上表现出显著的降血脂、抗氧化、抗炎和保肝活性。 (3) FA-HT使STZ糖尿病模型小鼠血糖水平降低12.96%(P<0.05)，同时升高SOD和降低MDA水平，表现出抗氧化活性。 (4) FA-HT对高脂饲料联合STZ诱导的糖尿病模型小鼠具有显著降血糖作用，TG、TC和LDL-C水平明显降低，抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX的含量显著升高，降低脂质过氧化产物MDA水平，明显降低炎症因子TNF-α和CRP含量和肝功能指标AST、ALT、AKP和T-BIL水平，减少脂肪在肝脏的堆积，改善肾脏和保护胰腺的作用；FA-HT在糖尿病小鼠上表现出显著的降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎，保护肝脏、肾脏和胰腺等作用。 4. (1) 肠吸收结果显示，FA-HT在大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠和直肠的有效渗透系数Peff分别为(3.29~4.82)×10-4 cm/s、(2.97~3.79)×10-4 cm/s、(2.21~4.23)×10-4 cm/s、(1.73~1.84)×10-4 cm/s和(3.24~3.38)×10-4 cm/s，均大于FF的有效渗透系数Peff (1.96~2.06)×10-4 cm/s、(1.29~1.87)×10-4 cm/s、(1.46~1.75)×10-4 cm/s、(0.81~1.49)×10-4 cm/s和(1.75~2.37)×10-4 cm/s，在测定的浓度范围内二者均无浓度依赖性；二者在肠道的Peff均大于0.2×10-4 cm/s，表示FA-HT和FF在肠道均易于吸收；在实验剂量下FA-HT的肠吸收较FF增加；FF与HT等摩尔混合时，HT不影响FF在大鼠肠段的吸收，而FF对HT在肠道的吸收表现出抑制作用。 (2) 体外代谢结果显示，在肠内容物中，FA-HT代谢较少，在全血、血浆、血细胞和肝匀浆中，FA-HT被迅速代谢为FA和HT。 (3) FA-HT在正常大鼠体内代谢研究结果显示，FA-HT可以代谢为FA和HT，FA-HT的吸收较FF增加，同时较混合物FF+HT中FF和HT的吸收均增加。单体FF与混合物FF+HT中的FF的吸收没有差异。混合物FF+HT的代谢产物FA的血药浓度达峰时间较单体FF滞后约50 min，说明HT会影响FF在正常大鼠体内的代谢过程。单体HT较混合物FF+HT中HT消除快。 (4) 血浆蛋白结合率结果显示，FA与血浆蛋白的结合率为78.8%~84.7%，HT并不影响FA的血浆蛋白结合率(79.2%~86.0%)；HT与血浆蛋白的结合率为11.5%~12.7%，而FA可以提高HT与血浆蛋白的结合率(25.7%~26.9%)。 结论： 1. FF经天然抗氧剂HT结构优化得到化合物FA-HT，其在肠道的吸收易于FF，并且在体内可以代谢生成FA和HT，共同发挥药理作用；FA-HT的降血脂活性较FF得到改良，降脂谱更广，同时具有降血糖、抗氧化、抗炎以及保护肝脏、肾脏和胰腺等作用；FA-HT对糖尿病状态下的血脂异常也具有明显的改善作用。 2. FA-HT较FF的肝毒性得到明显改善，为其它肝毒性化合物的结构优化提供思路。 3. FA-HT有望进一步开发为具有多重药理活性且不良反应少的降血脂候选化合物，为高脂血症及相关疾病的治疗提供更多选择。

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保肝活性 贝特衍生物 降血糖 降血脂 药物代谢动力学

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本发明公开了羟基酪醇醋酸酯在改善血管内皮功能障碍疾病中的应用，属于医药卫生技术领域，本发明以血管内皮SIRT6特异性敲除的纯合型(SIRT6endo‑/‑)小鼠和同窝阴性(SIRT6endo+/+)小鼠为研究对象，通过腹腔注射泊洛沙姆407(0.5g/kg/2day)一个月诱导建立高脂血症炎症小鼠模型，研究发现羟基酪醇醋酸酯具有降低血脂及血管炎症的作用，且是通过SIRT6介导的PKM2发挥抗血管内皮炎症作用的。在细胞水平，以人脐静脉内皮细胞为对象，发现羟基酪醇醋酸酯具有抗血管内皮细胞氧化应激和炎症的作用，并进一步通过TNFR1中和抗体、腺病毒高表达SIRT6或siRNA沉默SIRT6等技术，发现羟基酪醇醋酸酯通过TNFR1‑SIRT6‑PKM2信号通路发挥抗血管内皮细胞炎症作用。

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背景及目标：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作为神经退行性病变中最高发的疾病，症状主要表现为认知能力退化和身体机能恶化，不仅降低患者生活质量，同时为患者家庭带来沉重负担。随着世界人口老龄化的加剧，中国作为人口众多的发展中国家，将面临阿尔茨海默病带来的严峻挑战。流行病学研究发现，糖尿病与阿尔茨海默病的发病有关，糖尿病患者中阿尔茨海默病发病率升高1倍以上，因此AD又称III型糖尿病。但是，糖代谢参与阿尔茨海默病发生的分子机制仍不清楚。越来越多的证据表明阿尔茨海默病患者伴随多种相关疾病，包括糖脂代谢紊乱、骨代谢紊乱等，提示阿尔茨海默病是一种系统性、代谢性疾病，其病理学发生过程共同存在于脑和外周组织中。本研究旨在探索糖代谢与阿尔茨海默病及其相关疾病之间的作用机制，寻找可能的药物作用靶点，为预防和治疗这些疾病提供新的策略和思路。 实验内容与方法：本研究分别在神经元、转基因AD模型小鼠（APP/PS1）中对神经细胞糖代谢、认知功能和AD相关骨代谢进行研究，探索糖代谢参与AD发生发展的规律，并采用代谢调节活性分子干预AD模型小鼠，进一步证实代谢调节对AD病理发生的作用机制。我们首先在原代神经细胞和人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y中，通过不同浓度葡萄糖干预，使用海马生物能量仪测定线粒体呼吸功能，检测葡萄糖水平对胰岛素信号通路和神经细胞功能的影响。为探索糖代谢紊乱对AD的影响，我们采用高脂饲料饲喂转基因AD模型小鼠，观察小鼠糖代谢与骨代谢特征。最后，采用前期研究证实的代谢调节活性分子-羟基酪醇，对AD模型小鼠进行6个月的干预，检测其代谢相关生化指标及认知功能。 实验结果：1）通过使用生理条件下脑内葡萄糖浓度作为对照，以糖尿病条件下的高葡萄糖浓度对原代神经细胞和SH-SY5Y细胞进行糖浓度梯度处理，发现高葡萄糖在上述细胞中均能引起显著的线粒体功能紊乱及胰岛素抵抗。2）高葡萄糖处理显著抑制神经细胞的AMPK活性，并发现糖尿病模型db/db小鼠脑内也表现为AMPK活性降低；通过抑制剂、siRNA和基因敲除等进行分析，均显示AMPK活性降低可引起神经细胞胰岛素抵抗；而采用白藜芦醇和羟基酪醇激活AMPK，能够改善高葡萄糖引起的神经细胞线粒体功能紊乱和胰岛素抵抗。3）与AD模型小鼠相比，高脂饲喂的AD小鼠血糖水平升高，呈现显著的胰岛素抵抗。但高脂饲喂不仅未见导致小鼠认知功能的进一步损伤，而且显著改善骨质疏松症。4）羟基酪醇通过改善AD模型小鼠的葡萄糖耐受能力和线粒体氧化应激，抑制神经细胞炎症及凋亡，显著改善小鼠认知行为学。 实验结论：1）本研究发现了高葡萄糖水平可诱导神经细胞胰岛素抵抗，并证明了神经胰岛素抵抗是关联糖尿病和AD中枢神经系统病变的共同病理特征，且阐明了AMPK及线粒体功能紊乱在高糖引起的胰岛素抵抗中的关键作用。2）本研究发现，高脂饮食改善阿尔茨海默病引起的的骨质疏松。3）羟基酪醇通过调控葡萄糖代谢和线粒体氧化应激，改善APP/PS1小鼠的认知功能。以上研究为糖尿病与阿尔茨海默病的关联性研究提供了实验和理论基础，同时也为阿尔茨海默病的预防和治疗提供了新的策略和重要候选药物。

Keyword ：

AMPK 阿尔茨海默病 骨质疏松症 羟基酪醇 神经细胞胰岛素抵抗 线粒体

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高脂血症（Hyperlipidemia）是动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死、脑中风等心脑血管疾病及代谢综合征的重要危险因素，其中高甘油三酯血症（Hypertriglyceridemia）的发病率明显高于高胆固醇血症且呈上升趋势，高甘油三酯血症在心脑血管及相关疾病中的作用越来越得到重视，治疗和控制高甘油三酯血症具有重要意义，以降甘油三酯为特征的贝特类降脂药（Fibrates）在降血脂及相关疾病治疗中具有特殊作用。由于心脑血管疾病病理机制复杂，涉及到氧化应激、炎症、血小板活化等多种因素，因此抗氧化等多靶标干预更具意义。 目的： 将氯贝丁酸与天然抗氧化结构片段通过分子杂合形成多功能化合物，对其抗氧化、抗血小板聚集、抗糖基化、降血脂及降低肝损伤等多重活性进行评价，以期得到有效、低毒的多功能降血脂化合物，为氯贝丁酯的二次开发提供实验依据。 方法： （1）羟基酪醇与溴化苄反应保护酚羟基，与氯贝丁酸在EDCI和DMAP作用下进行酯缩合，或者与溴乙酸酯化后再与氯贝丁酸缩合，然后在H2/Pd-C作用下脱保护分别得T1和T2；3,4-二羟基苯甲酸经苄基保护酚羟基，分别与2-溴乙醇或3-溴丙醇酯缩合，然后与氯贝丁酸反应，再经H2/Pd-C作用脱保护分别得T3和T4；3,4-二羟基苯乙酸经相同方法得T5和T6；氯贝丁酸先与草酰氯反应，然后在NaH的作用下与2-巯基噻唑啉发生胺解反应，最后在过氧甲酸作用下发生氧化开环得T7。 （2）采用紫外分光光度法对目标化合物自由基清除活性（DPPH·和OH·）、抗脂质过氧化能力和总还原能力进行测定； （3）采用荧光分析法通过牛血清白蛋白（BSA）-丙酮醛（MGO）体系评价化合物的抗糖基化能力； （4）通过ADP诱导血小板聚集实验评价化合物抗血小板聚集活性； （5）采用Triton WR 1339诱导高脂血症小鼠模型评价化合物T1（CF-HT）和T7（CF-Tau）的降血脂活性及抗氧化活性； （6）正常小鼠长期给药，通过测定肝功生化指标（AST、ALT、AKP、TBIL）及抗氧化指标（CAT、SOD、GSH、GSSG、MDA）对化合物T1（CF-HT）的肝损伤活性进行评价。 结果： （1）合成了7个氯贝丁酸衍生物，均为新化合物，T1结构经1H-NMR、13C-NMR、EI-MS表征确认，其余化合物结构经1H-NMR表征确认。 （2）体外抗氧化活性实验结果显示，目标化合物T1～T6在多个氧化还原体系中均表现出明显的抗氧化活性。其OH·清除活性和抗脂质过氧化能力依次为：T1≈T2＞T5≈T6＞T3≈T4，DPPH·清除活性和总还原能力依次为：T5≈T6＞T3≈T4＞T1≈T2，而化合物T7未表现出抗氧化活性。 （3）体外抗糖基化实验结果表明，化合物T1、T2、T5的抗糖基化活性强于阳性药氨基胍AG（IC50 = 0.228 mM），其IC50依次为0.155 mM、0.214 mM、0.165 mM。T3、T4、T6、T7表现出弱的抗糖基化活性。 （4）体外抗血小板聚集活性结果显示，化合物T1～T7对ADP诱导血小板聚集表现出不同程度的抑制活性，在200 μmol/L时，化合物T1（78.0%）、T7（76.3%）、T5（66.0%）的抗血小板聚集活性强于氯贝丁酯（64.5%），T2、T3、T4、T6的抑制率虽低于氯贝丁酯但强于阿司匹林（30.7%）。 （5）化合物CF-HT（T1）对急性高脂模型小鼠有良好的降脂活性（显著降低TG、TC、LDL-C），并且降低高脂状态下脂质过氧化产物MDA水平；化合物CF-Tau（T7）对急性高脂小鼠仅具有降低TG和TC的作用。 （6）生化指标与肝组织形态学变化均表明CF-HT具有明显的肝保护作用。正常小鼠长期服用氯贝丁酯导致肝功能指标AST、ALT、AKP、TBIL、肝脏系数均显著升高，氧化还原状态的失衡；CF-HT组肝功能指标只表现出了轻微的异常，仅肝脏系数和AST偏高，其它指标与正常组无差异，抗氧化酶水平明显升高。 结论： 氯贝丁酸与抗氧化结构经分子杂合衍化后，具有明显的抗氧化、抗血小板聚集、抗糖基化作用；CF-HT较氯贝丁酯降脂活性得到改良，氧化应激状态和肝毒性得到明显改善，有望成为一种有效、低毒的多功能降脂化合物。

Keyword ：

肝损伤 高脂血症 合成 氯贝丁酸衍生物 氧化应激

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Abstract ：

研究目的： 众所周知，动脉粥样硬化是绝大多数心血管疾病潜在的病理学基础。脉管系统的脂蛋白堆积是动脉粥样硬化早期的一个重要事件。最新研究结果表明，抑制巨噬细胞自噬过程能够阻止胆固醇流出。另有研究报道发现，异常的脂质修饰和代谢过程已被认为可以触发动脉粥样硬化斑块当中固有的炎症反应，且这一过程被发现与巨噬细胞的溶酶体降解系统密切相关。上述研究提示，巨噬细胞自噬在动脉粥样硬化的发病机制中扮演着重要作用。我们课题组前期的研究发现，组蛋白去乙酰化酶Sirtuin 1（SIRT1）通过调控血管内皮和外膜的炎症过程，进而产生心血管保护作用。本研究旨在探讨SIRT1对oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）刺激THP-1源性单核巨噬细胞的自噬过程是否存在调控作用，并进一步研究橄榄油中多酚类活性单体羟基酪醇（hydroxytyrosol，HT）对THP-1源性巨噬细胞自噬的影响及其作用机制。 研究方法： 1. 自噬对ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞脂质沉积的影响 体外培养人单核THP-1细胞，加入佛波酯（PMA）诱导THP-1细胞分化为THP-1源性巨噬细胞，继续给予ox-LDL孵育THP-1单核巨噬细胞使其分化为泡沫细胞。采用油红O（oil red O，ORO）染色观察ox-LDL诱导巨噬细胞源性泡沫细胞的脂质沉积。运用western blotting检测MCP-1的表达变化。利用细胞免疫荧光染色观察ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞SIRT1的移位和表达情况。进一步引入mRFP-GFP-LC3双荧光检测系统观察ox-LDL诱导巨噬细胞源性泡沫细胞自噬水平的改变。应用自噬抑制剂（3-Methyladenine，3-MA）和自噬相关基因5（autophagy-related gene，Atg5）沉默观察自噬对ox-LDL诱导THP-1单核巨噬细胞脂质沉积过程和MCP-1表达的影响。 2. 动脉粥样硬化过程中自噬水平和SIRT1表达的变化 载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因缺失（ApoE-/-）小鼠行颈总动脉套管术并辅以高脂饲料喂养构建小鼠动脉粥样硬化模型。于颈总动脉套管术后不同时间点取ApoE-/-小鼠套管侧、近心端的颈总动脉等组织，采用H&E染色观察套管术合并高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠颈总动脉内膜以及主动脉瓣膜处的结构改变。运用ORO染色检测ApoE-/-小鼠颈总动脉内膜以及主动脉瓣膜处的脂质蓄积。利用免疫组化染色检测ApoE-/-小鼠颈总动脉内膜及其斑块内巨噬细胞的浸润水平情况。此外，进一步采用western blotting和组化染色观察ApoE-/-小鼠套管侧颈总动脉内膜及其斑块内的SIRT1表达变化以及自噬相关蛋白LC3的表达情况。 3. SIRT1通过去乙酰化修饰自噬相关蛋白Atg5调控巨噬细胞自噬 继续选用ApoE-/-小鼠行颈总动脉套管术并辅以高脂饮食构建小鼠动脉粥样硬化模型，并分别于套管术后4 w和8 w给予ApoE-/-小鼠SIRT1抑制剂EX-527 4 w。EX-527干预结束后，首先采用免疫组化染色和western blotting验证EX-527处理对ApoE-/-小鼠颈总动脉组织SIRT1表达的影响。进一步分离套管侧颈总动脉切片并运用H&E染色观察颈总动脉内膜粥样斑块的变化情况。运用ORO染色观察颈总动脉内膜及其斑块的脂质聚集程度。在体外实验中，应用SIRT1抑制剂EX-527和SIRT1基因沉默以及SIRT1过表达腺病毒，观察SIRT1对ox-LDL诱导单核巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响以及MCP-1表达的变化。最后，进一步利用western blotting和immunoprecipitation（IP）技术确证ox-LDL影响THP-1单核巨噬细胞的自噬是否依赖于SIRT1的调控作用，以及SIRT1调控细胞自噬的具体机制是否与其介导的Atg5去乙酰化修饰有关。 4. 羟基酪醇对巨噬细胞脂质沉积的影响及其分子机制研究 首先，体外诱导并分化人THP-1单核巨噬细胞，给予天然活性多酚类抗氧化剂羟基酪醇处理，观察其对ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞脂质沉积的作用和MCP-1蛋白表达的影响。同时，观察羟基酪醇对THP-1源性巨噬细胞SIRT1表达和自噬水平的影响。接下来，分别抑制自噬过程和SIRT1表达后，观察羟基酪醇对ox-LDL诱导THP-1单核巨噬细胞脂质沉积和MCP-1表达的影响，并确证羟基酪醇对单核巨噬细胞的脂质沉积和MCP-1表达是否与SIRT1介导的自噬过程有关。最后，进一步应用western blotting和IP技术探究羟基酪醇是否通过SIRT1介导的Atg5去乙酰化作用调控THP-1巨噬细胞自噬。 研究结果： 1. 抑制自噬促进ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞的脂质沉积 根据ORO染色结果可知，ox-LDL刺激可诱导单核巨噬细胞泡沫细胞的形成，显著上调MCP-1的蛋白表达水平。Western blotting和细胞免疫荧光染色结果显示，ox-LDL刺激导致THP-1源性巨噬细胞SIRT1表达下降且并有部分转移至细胞质中。mRFP-GFP-LC3双荧光检测系统和western blotting实验结果显示，ox-LDL刺激抑制THP-1单核巨噬细胞的自噬水平，且与阻止细胞自噬体的形成有关。此外，进一步抑制细胞的自噬活动后，ox-LDL诱导单核巨噬细胞脂质沉积的程度进一步加剧，但并未进一步引起MCP-1蛋白表达水平的变化。 2. ApoE-/-小鼠行套管术合并高脂饮食抑制颈动脉组织SIRT1的表达 H&E和ORO染色结果显示，ApoE-/-小鼠行套管术合并高脂饮食处理8 w，可导致其颈总动脉内膜以及主动脉瓣膜处产生大量粥样斑块，且伴有明显的脂质堆积。免疫组化染色结果显示，ApoE-/-小鼠颈总动脉斑块内可见明显的巨噬细胞浸润。进一步的western blotting和免疫组化染色结果显示，给予ApoE-/-小鼠套管术合并高脂饮食饲喂8 w后，能够显著抑制其颈总动脉组织SIRT1的表达，但对自噬相关指标LC3的蛋白表达变化未见显著影响。 3. SIRT1通过自噬调控ox-LDL诱导THP-1单核巨噬细胞的脂质沉积 ApoE-/-小鼠颈总动脉的H&E和ORO染色结果显示，SIRT1抑制剂EX-527处理小鼠4 w后能够进一步促进套管术合并高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠颈总动脉内膜斑块扩大和脂质蓄积，且能够募集更多的巨噬细胞浸润。但是ApoE-/-小鼠颈总动脉切片的免疫组化染色结果显示，抑制SIRT1并不能导致ApoE-/-小鼠颈总动脉组织的自噬水平发生变化。而体外实验研究结果表明，调控THP-1单核巨噬细胞SIRT1的表达水平能够改变ox-LDL诱导巨噬细胞脂质沉积的程度。进一步的体外研究结果发现，干预SIRT1的表达水平能够引起自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62表达趋势的变化，且能够进一步改变自噬相关蛋白Atg5的乙酰化水平。 4. 羟基酪醇减缓ox-LDL诱导THP-1单核巨噬细胞的脂质沉积 细胞ORO染色结果表明，羟基酪醇能够减缓ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞泡沫细胞的形成，且能够影响MCP-1的分泌水平。进一步下调自噬水平或者SIRT1表达均能够阻断羟基酪醇对ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫细胞形成的抑制作用。此外，western blotting和IP结果显示，羟基酪醇可显著抑制ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞自噬相关蛋白Atg5的乙酰化水平。体内ApoE-/-小鼠颈总动脉初步的ORO染色结果显示，给予羟基酪醇处理4 w后，能够抑制套管术合并高脂饮食诱导的小鼠颈总动脉内膜及其斑块内脂质的进一步聚集。 研究结论： 1. 抑制自噬加剧ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞的脂质沉积。 2. ApoE-/-小鼠行颈总动脉套管术并辅以HFD喂养，颈总动脉内膜可见明显的粥样斑块产生，且伴有SIRT1的表达水平下调。 3. SIRT1能够通过去乙酰化修饰自噬相关蛋白Atg5调控巨噬细胞自噬。 4. 羟基酪醇可能通过SIRT1介导的自噬相关蛋白Atg5的去乙酰化作用，减缓巨噬细胞的脂质沉积。

Keyword ：

Atg5 SIRT1 羟基酪醇 去乙酰化作用 自噬

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代谢 分布 机制 羟基酪醇 生物学活性 线粒体营养素

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