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目的：轻度脑外伤患者占脑外伤患者的80%以上。多数轻度脑外伤患者在CT检查上未见异常，因此绝大部分患者选择自我调养、恢复而非就医。事实上，轻度脑外伤发生后可能会导致持续性的认知功能下降和神经行为功能障碍，神经化学、代谢和细胞的改变可能会引发脑血流的改变，而脑血流的改变被认为是继发性损伤和脑修复缓慢的原因之一。本研究旨在利用动脉自旋标记(arterial spin labeling,ASL)磁共振成像技术评估轻度脑外伤患者脑血流值随病程进展的变化情况。方法：采集在温州医科大学附属第二医院门诊或急诊就医的43例轻度脑外伤患者的临床信息，同时纳入年龄、性别和受教育程度匹配的43例健康受试者作为对照组...

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磁共振成像 动脉自旋标记 脑血流 轻度脑外伤

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目的: 轻度脑外伤患者占脑外伤患者的80%以上。多数轻度脑外伤患者在CT检查上未见异常，因此绝大部分患者选择自我调养、恢复而非就医。事实上，轻度脑外伤发生后可能会导致持续性的认知功能下降和神经行为功能障碍，神经化学、代谢和细胞的改变可能会引发脑血流的改变，而脑血流的改变被认为是继发性损伤和脑修复缓慢的原因之一。本研究旨在利用动脉自旋标记(arterial spin labeling，ASL)磁共振成像技术评估轻度脑外伤患者脑血流值随病程进展的变化情况。方法: 采集在温州医科大学附属第二医院门诊或急诊就医的43例轻度脑外伤患者的临床信息，同时纳入年龄、性别和受教育程度匹配的43例健康受试者作为对照组，所有受试者均接受脑部磁共振成像扫描，并进行临床神经心理学评估和认知功能评估。对其中22名轻度脑外伤受试者在急性期、第1个月、第3个月和第12个月进行随访。以对照组为基准，分析轻度脑外伤患者的异常脑血流区域，并以异常区域作为后续的感兴趣区(region of interest，ROI)。分析各ROI中的脑血流值与临床指征、认知功能的相关性以及轻度脑外伤患者在后续随访的各时间点ROI中脑血流值的变化。结果: 与对照组比较，轻度脑外伤组急性期在皮质区域的双侧背外侧额上回和双侧辅助运动区以及在皮下核团的右侧壳核、尾状核、苍白球、旁海马区域的脑血流值显著升高(均P<0.01，TFCE-FWE校正)。脑血流值与神经心理学评分以及各认知域认知量表评分的相关性分析结果显示：轻度脑外伤组全脑(r=0.528，P<0.001)、右侧尾状核(r=0.512，P<0.001)、壳核(r=0.486，P<0.001)和苍白球(r=0.426，P=0.006)脑血流值与评估工作记忆能力的倒背数字广度测验(Backward Digit Span Task，BDST)评分呈正相关，而右侧苍白球脑血流值与创伤后应激障碍评分(Post-Traumatic Stress Disorder Cheeklist-Civilian Version，PCL-C)呈负相关(r=-0.402，P=0.010)。在随访期间，这些区域的异常脑血流改变均未恢复，而在第1个月，3个月和12个月时脑血流值与PCL-C和BDST之间无相关性(均P>0.05)。结论: 脑血流值代谢升高是急性期轻度脑外伤患者脑损伤的应激特征之一；其多个皮层或皮层下区域的脑血流值均存在异常的升高，且这些异常区域的脑血流值在后续随访期间均无明显改变，提示轻度脑外伤患者亟需采取潜在的临床治疗手段。.OBJECTIVES: The patients with mild traumatic brain injury (mTBI) accounts for more than 80% of the patients with brain injury. Most patients with mTBI have no abnormalities in CT examination. Therefore, most patients choose to self-care and recover rather than seeking medical treatment. In fact, mTBI may result in persistent cognitive decline and neurobehavioral dysfunction. In addition, changes occurred in neurochemistry, metabolism, and cells after injury may cause changes in cerebral blood flow (CBF), which is one of the causes of secondary injury and slow brain repair. This study aims to evaluate the changes of CBF with the progression of the disease in patients with mTBI based on arterial spin labeling (ASL) magnetic resonance imaging technology. METHODS: In the outpatient or emergency department of the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 43 mTBI patients were collected as an mTBI group, and 43 normal subjects with age, gender, and education level matching served as a control group. They all received clinical neuropsychology and cognitive function evaluation and magnetic resonance imaging. In the mTBI group, 22 subjects were followed up at acute phase, 1 month, 3 months, and 12 months. Based on the control group, the abnormal regions of CBF in the whole brain of mTBI patients were analyzed. The abnormal regions were taken as the regions of interest (ROI). The correlation of the values of the CBF in ROIs with clinical indications, cognitive function, and the changes of CBF in ROI at each time point during the follow-up were analyzed. RESULTS: Compared with the control group, the CBF in the bilateral dorsolateral superior frontal gyrus and auxiliary motor areas in the cortical region, as well as the right putamen, caudate nucleus, globus pallidus, and parahippocampus in the subcutaneous regions in the acute phase of the mTBI group were significantly increased (all P<0.01, TFCE-FWE correction). The analysis results of correlation of CBF with neuropsychology and cognitive domain showed that in the mTBI group, whole brain (r=0.528, P<0.001), right caudate nucleus (r=0.512, P<0.001), putamen (r=0.486, P<0.001), and globus pallidus (r=0.426, P=0.006) values of the were positively correlated with Backward Digit Span Test (BDST) score (reflectting working memory ability), and the right globus pallidus CBF was negatively correlated with the Post-Traumatic Stress Disorder Cheeklist-CivilianVersion (PCL-C) score (r=-0.402, P=0.010). Moreover, the follow-up study showed that abnormal CBF in these areas had not been restored. The correlation of CBF was negatively correlated with PCL-C and BDST at 1 months, 3 months, and 12 months (all P>0.05). CONCLUSIONS: The elevated CBF value is one of the stress characteristics of brain injury in the mTBI patients at the acute phase. There is abnormal elevation of CBF values in multiple cortex or subcortical areas. Multi-time point studies show that there is no obvious change of CBF in abnormal areas, suggesting that potential clinical treatment is urgently needed for the mTBI patients.

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arterial spin labeling; cerebral blood flow; magnetic resonance imaging; mild traumatic brain injury

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脊髓损伤(SCI)是一种高致残率、高病死率并且至今尚无有效方法可治愈的中枢神经系统疾病,可造成脊髓横断性损伤,致损害平面以下运动、感觉及自主神经功能障碍。SCI病理发生机制包括原发性损伤与继发性损伤,继发性损伤是指在原发性损伤基础之上,受损的周围组织进一步发生病变,导致损伤的程度加深、范围扩大等改变,其中微环境的改变与损伤程度及预后水平之间存在一定的相关性。存在于中枢神经系统中、由星型胶质细胞和少突胶质细胞等分泌的S100β蛋白在各种原因所致的脑损伤及颅脑疾病中均有一定程度的高表达。近年研究发现S100β蛋白与脊髓损伤的病理机制存在一定的相关性,本文通过对S100β蛋白在脊髓损伤中的相关作用做...

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S100β蛋白 脊髓损伤 继发性损伤 神经系统损伤

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研究背景： 弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）以脑组织内弥散性神经元及轴索损伤为特征，是创伤性脑损伤后意识障碍的主要原因；临床诊断困难，重残及持续植物状态率高，一直是神经外科颅脑外伤领域研究的热点及难点。DAI通常是一个进展性病理过程，根据病理生理过程分为原发性脑损伤及继发性脑损伤。原发性脑损伤是指由外力直接作用而造成的神经轴索的肿胀、甚至断裂及轴索回缩球的形成。继发性脑损伤是在原发性脑损伤为基础后轴膜通透性改变、Ca2+平衡紊乱、轴浆运输障碍、线粒体损伤及能量代谢障碍、氧化应激以及神经免疫炎症反应等多种因素的作用下出现的一系列生化及细胞反应导致的迟发性神经元损伤。目前对于DAI后继发性脑损伤的研究集中在钙超载及神经兴奋性毒性、氧化应激、细胞凋亡、神经免疫炎症及自噬等等。然而内质网作为蛋白合成，脂质代谢及Ca2+代谢调节的主要细胞器，对维持机体细胞稳态至关重要。内质网对各种应激极为敏感，当其受到如缺氧、毒性蛋白的蓄积、营养物质的缺乏等有害因素刺激下，其稳态遭到破坏，内质网腔内出现未折叠或错误折叠蛋白的异常聚集以及Ca2+浓度的失衡，进而导致内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的发生。当ERS发生时机体会触发未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），其是机体一种保守适应机制，以减轻ERS造成的机体损伤，起到保护作用。然而当ERS持续且强烈时，UPR不足以代偿ERS，则UPR开始激活细胞压力相关信号通路，最明显的是炎症通路的激活，“警告”细胞内环境致使其发生适当的更广泛组织反应，以应对强烈的ERS。如果这些机制都失败，UPR将诱导细胞的凋亡。ERS也参与多种中枢神经系统疾病的发病过程，如脑缺血-再灌注、神经退行性病变等。此外，研究认为Nrf2参与调控UPR-PERK通路，Nrf2-PERK通路是连接氧化应激与ERS之间的桥梁。Nrf2-PERK通路在DAI后继发性损伤中的作用机制目前仍不清楚。因此，对于DAI后ERS情况及Nrf2-PERK通路的研究，有助于探讨改善DAI后继发性脑损伤的新思路。 研究目的： 明确大鼠DAI后继发性脑损伤情况，包括神经元损伤及轴索损伤；明确大鼠DAI后脑皮层组织毒性蛋白蓄积情况及其引起的ERS通路相关蛋白表达变化；明确大鼠DAI后脑皮层组织内Nrf2及抗氧化应激通路表达变化；通过给予Nrf2特异性激动剂及特异性抑制剂观察Nrf2对于UPR-PERK通路的调控机制；最后探讨Nrf2-PERK通路介导DAI后继发性脑损伤的作用机制。 研究方法： 采用大鼠头颅瞬间旋转装置制作大鼠DAI模型，利用mNSS评分、体重监测等观察大鼠DAI后神经功能障碍情况；利用银染、LFB染色、IHC染色（β3-Tubulin、Tau、β-APP及NF-H）观察DAI后轴索损伤情况；通过HE染色、尼氏染色、刚果红染色、TUNEL染色及IHC染色（Cleaved-caspase-3、DAPK1）观察DAI后神经元损伤、淀粉样变性及凋亡情况；利用Western blot检测DAI大鼠皮层不同时间点（6h、1d、3d及7d）毒性蛋白Aβ、p-Tau的蓄积情况及凋亡相关通路蛋白（Cleaved-caspase-3、Caspase-3、BAX及Bcl-2）的动态表达变化，充分评价大鼠DAI后继发性脑损伤。利用Western blot观察DAI后Nrf2介导的抗氧化应激通路及ERS通路相关蛋白（p-PERK、p-eIF2α、ATF4及CHOP）表达变化。通过给予Nrf2干预药物Curcumin及ML385后利用Western blot及胞核胞浆蛋白分离提取技术观察Nrf2核转移情况，并利用Western blot及免疫荧光双标观察干预后UPR-PERK通路相关蛋白的表达变化。利用Western blot（BACE1、Aβ、GSK3β、p-GSK3β及p-Tau）、免疫组化（β-APP、NFH及GAP43）及透射电镜观察给予Curcumin后DAI大鼠皮层组织内毒性蛋白蓄积情况及神经轴索的病理改变；利用Western blot（DAPK1、NMDAR-NR2b、Cleaved-caspase-3、Caspase-3、BAX及Bcl-2）及TUNEL染色观察给予Curcumin后DAI大鼠皮层组织内神经元细胞凋亡情况；利用免疫组化及荧光（GFAP、Iba-1）观察给予Curcumin后DAI大鼠皮层组织内胶质细胞活化情况及利用ELISA技术观察炎症因子（TNFα、IL-1β、IL-6等）表达情况；利用免疫组化（P62、LC3BII及Beclin-1）观察给予Curcumin后DAI大鼠皮层组织内自噬的情况。 研究结果： DAI组大鼠均在损伤后表现出部分神经功能障碍，观察到大鼠DAI后mNSS评分升高，脑水含量增多及体重减轻；DAI后神经功能障碍与DAI后轴索损伤及神经元死亡有关，实验发现DAI后神经元细胞核固缩，胞体肿胀，深染，存在淀粉样变性，甚至死亡；轴索迂曲、肿胀，甚至断裂，轴索回缩球形成；上述结果符合DAI后病理改变。DAI后毒性蛋白Aβ、p-Tau表达增多，伴随着ERS相关蛋白（p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP等）表达增多；DAI后UPR起始阶段通路蛋白p-PERK及p-eIFα在6h便开始明显升高，在3d时达到高峰；而ATF4及CHOP蛋白表达在均在1d时开始明显升高，7d时达到高峰。DAI后6h、1d时Nrf2细胞核内转移明显升高，而在3d、7d时Nrf2细胞核内转移明显减弱。此外，DAI后抗氧化应激在6h已经开始发挥作用，其与Nrf2激活并核内转移一致。通过给予DAI大鼠Nrf2特异性激动剂Curcumin及特异性抑制剂ML385发现，Curcumin能够促进Nrf2核转移，能够上调p-PERK、p-eIF2α的表达，抑制ATF4及CHOP的表达；而ML385能够抑制Nrf2核转移，下调p-PERK及p-eIF2α的表达，上调ATF4及CHOP的表达。给予Curcumin后能够明显降低DAI后脑水肿，降低mNSS评分，改善DAI后继发性神经元损伤及轴索损伤；给予Curucmin后能够降低毒性蛋白（Aβ、p-Tau）的蓄积及促进神经元再生相关蛋白NF-H、GAP43的表达；给予Curcumin后能够抑制DAPK1、NMDAR-NR2b蛋白及凋亡通路相关蛋白表达；给予Curcumin后能够促进HO-1、NQO1的表达，抑制GFAP及IBA表达及促炎症因子释放；给予Curcumin后能够下调自噬相关蛋白LC3BII、Beclin-1及上调p62的表达。 结论： 1. DAI后大鼠存在一定程度的神经功能障碍，与皮层组织内继发性神经元损伤、变性、死亡及轴索肿胀、断裂有关；其中可能的继发性脑损伤机制为毒性蛋白蓄积、凋亡通路的激活、过度胶质化反应及自噬过程等。 2. DAI后Nrf2激活并核转移，并激活下游的抗氧化应激通路（HO-1、NQO1）。 3. DAI后ERS持续存在，并逐渐的增强；DAI早期（6h内）UPR能够代偿ERS，表现为继发性脑损伤较轻，ERS标志性蛋白ATF4、CHOP表达低水平；DAI中晚期（1d~7d时）UPR处于失代偿，无法对抗ERS，表现为继发性脑损伤加重，ATF4、CHOP表达升高。 4. Nrf2通路激活能够上调p-PERK、p-eIF2α的表达，提高UPR能力；抑制ATF4、CHOP表达，降低ERS损伤，改善神经功能障碍。 5. Nrf2通路抑制能够下调p-PERK、p-eIF2α的表达，降低UPR能力；上调ATF4、CHOP表达，加重ERS损伤，促进神经元细胞凋亡，加重神经功能障碍。 6. Curcumin能够通过调控Nrf2-PERK通路增强大鼠DAI后UPR能力，对抗毒性蛋白（Aβ、p-Tau）蓄积导致的ERS；同时，改善ERS介导的细胞凋亡、过度胶质化反应及过度自噬等病理改变，改善DAI后继发性脑损伤。

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红系衍生的核转录相关因子2 弥漫性轴索损伤 内质网应激 未折叠蛋白反应 氧化应激

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背景： Pilon骨折是一种常见的踝关节高能量损伤，常伴有严重的软组织损伤并发症，后期踝关节功能恢复比较困难，致残率较高，近年来对该种损伤的治疗受到越来越多的重视。因此如何正确选择合适的手术方法及手术时机亟需解决。 目的： 对比常规早期手术治疗及利用损伤控制理论分步延期治疗 Pilon骨折的临床疗效，探讨损伤控制理论在Pilon骨折治疗过程中的临床应用价值。 方法： 回顾性分析2012年1月--2015年12月在我院手术治疗的Pilon骨折患者。2012年1月--2013年12月住院的患者给予早期手术治疗，为对照组；2014年1月--2015年12月患者利用损伤控制理论给予分步延期治疗，为观察组。观察组：男28例，女14例，受伤时间为1-18小时，平均受伤时间为（4.92±0.56）小时；年龄21-56岁，平均年龄为（34.63±2.54）岁；受伤机制：交通意外伤14例；高处坠落伤28例，骨折分型（Ruedi-Allgower分型）Ⅱ型16例，Ⅲ型26例。对照组：男26例，女12例；受伤时间为1-36小时，平均受伤时间为（5.10±0.69）小时；年龄20-57岁，平均年龄为（36.12±2.69）岁；受伤机制：高处坠落伤28例，交通意外伤10例；骨折分型（Ruedi-Allgower分型）Ⅱ型16例，Ⅲ型22例。两组患者入院后均予以常规术前检查及评估，踝关节三维 CT扫描了解关节面移位及下胫腓联合前后骨嵴的损伤情况。观察组先给予跟骨牵引维持软组织张力及长度，皮肤挫伤明显者评估骨折手术较晚者予以外固定架固定，等待患肢伤区皮肤条件成熟、皮纹征阳性后再行内固定手术，手术方案为切开复位锁定板或解剖板内固定，通过不同的入路来显示骨折的部位、恢复踝穴正常结构，精确骨折对位，以达到胫骨远端关节面平整性恢复。对照组在入院后8-10小时内完成切开复位内固定，手术方式同观察组。 两组患者术后处理相同，均予以垫高患肢，抗生素预防感染，消肿、理疗促进伤口愈合及预防血栓治疗，术后两天即开始进行下肢肌肉功能锻炼及踝关节早期功能锻炼。术后两组患者均进行12-24月的随访（15.52±2.23月）。比较两组患者手术时间，软组织并发症，术前和术后血像，皮纹征阳性时间，下地时间，骨折愈合时间，术后3、6、12月Baird踝关节评分。利用 SPSS 18.0统计软件进行数据分析处理，计量资料采用（）表示，采用t检验；计数的资料采用x²检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。 结果： 观察组的手术时间、软组织并发症、术前和术后WBC计数、皮纹征阳性时间、下地时间、骨折愈合时间均明显低于对照组（P＜0.05）。观察组切口延迟愈合5例，发生率为11.90%；对照组切口延迟愈合15例，发生率为39.47%。两组对比差异性具有统计学意义（P<0.05）。术后3、6、12月踝关节 Baird评分观察组明显高于对照组（P＜0.05）。 结论： 利用损伤控制理论分步延期手术治疗Pilon骨折，可以显著缩短手术时间、减小手术创伤后应激反应，减少皮肤软组织继发性损伤及感染，缩短下地时间及骨折愈合时间，踝关节功能相对早期手术患者治疗优良率明显提高。采用损伤控制理论分步延期手术治疗Pilon骨折是一种有效的治疗方法。

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Pilon骨折 分步延期手术 软组织并发症 损伤控制理论

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研究背景： TBI是临床最为常见脑损伤，弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）是TBI一种常见的病理损伤类型，是脑外伤患者昏迷的主要原因，目前仍缺乏有效的治疗手段。DAI后多种损伤产物的生成导致中枢和外周免疫炎性细胞的活化，从而激活神经炎症反应，神经炎症反应在DAI后继发性损伤中发挥着重要的作用。DAMPs是体内重要的损伤产物，只有在细胞损伤后释放至细胞外诱导机体防御性反应，其中以炎症反应为著。 HMGB1是DAMPs重要的分子之一，在细胞坏死时被大量释放进入细胞外间隙与TLRs和RAGEs受体结合，诱导炎性细胞因子的表达。DAI后神经炎症反应一方面可促进组织和神经细胞碎片的清除，促进损伤脑组织的修复和再生，但是另一方面也有研究提示过度活化的免疫炎性细胞还可释放大量的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，从而引起继发性神经炎症损伤。有研究报道指出外周炎性细胞的浸润在调节胶质细胞发挥组织修复或炎性损伤中扮演着重要作用。体外研究中发现HMGB1在发挥促炎作用的同时可诱导趋化因子CXCL12的释放，而CXCL12是诱导中性粒细胞向炎性损伤区域迁移的重要诱导因子。因此，DAI后HMGB1诱导CXCL12的表达可能参与外周白细胞向中枢神经系统浸润，并在DAI后神经炎性损伤中发挥着关键的作用。然而，目前有关HMGB1参与DAI后继发性脑损伤的具体病理机制还不明确，尤其是其在DAI后诱导外周白细胞浸润中的作用未见大量报道，进一步明确HMGB1在DAI中的作用具有重要意义，将为寻求改善DAI后神经炎症反应防止预后不良的方法提供必要的理论支持。 本研究中，我们以HMGB1信号通路为核心，以神经炎症反应为重点研究方向，采用分子生物学及免疫学方法检测HMGB1信号通路在DAI后的表达，应用HMGB1的特异性抑制剂，检测干预HMGB1通路对趋化因子CXCL12及其受体CXCR4表达、中性粒细胞浸润以及DAI后继发性损伤的影响，探讨HMGB1诱导神经元死亡以及神经轴索损伤的分子机制，以期为DAI的治疗提供新策略和新靶点。 研究目的： 1）通过体外原代神经元培养明确HMGB1对CXCL12表达的诱导作用。 2）明确DAI后早期脑损伤过程中HMGB1信号通路在脑组织中表达与炎症因子的动态改变。 3）明确DAI后轴索损伤相关蛋白的表达水平的改变、CXCL12/CXCR4的表达以及中性粒细胞浸润。 4）明确抑制HMGB1对DAI后CXCL12/CXCR4表达以及DAI后中性粒细胞浸润的影响。 5）明确抑制HMGB1后对DAI后血脑屏障完整性、轴索损伤以及神经细胞凋亡等继发性脑损伤的影响。 研究方法： 1）体外原代神经元培养，通过给予重组HMGB1观察其对CXCL12表达的诱导作用。免疫荧光双标鉴定原代培养神经元的纯度。免疫荧光双标和Western-blot观察不同剂量重组HMGB1对CXCL12表达水平的影响。此外，进一步在重组HMGB1干预的状态下联和给予不同剂量HMGB1抑制剂甘草酸，Western-blot检测CXCL12的表达。 2）以成年雄性SD大鼠为研究对象，随机分为正常对照组和DAI模型组6 h、24 h、48 h和72 h组；采用顺势旋转加速装置DAI模型，神经功能缺损评分检测造模后脑损伤程度；对照组和DAI 24h组采用HE染色观察DAI后神经元形态改变以及微血管损伤，FITC标记葡聚糖免疫荧光观察DAI后血脑屏障破坏，PTAH染色观察轴突形态变化，同时免疫组化β-APP染色显示轴突运输功能障碍；此外TTC染色观察DAI后是否存在局灶性脑损伤；对DAI造模成功大鼠进行神经功能评分。 3）Western-blot测定DAI后皮层脑组织和脑脊液HMGB1的动态表达，并测定皮层脑组织中炎症相关蛋白（TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9）和轴索损伤相关蛋白（β-APP、p-tau）的表达变化；采用免疫荧光双标染色检测HMGB1表达以及神经细胞定位。 4）免疫荧光检测DAI后脑组织皮层MBP的表达，评估DAI后髓鞘降解的程度；TUNEL法测定DAI后神经细胞凋亡；EVANs蓝尾静脉注射检测血脑屏障通透性。 5）采用免疫荧光双标染色检测CXCL12表达以及神经细胞定位，Western blot定量分析CXCL12/CXCR4的表达；免疫组织化学检测DAI后早期阶段以及干预后中性粒细胞活化标志物。 6）成年雄性SD大鼠被随机分为对照组、DAI组、DAI+GL组、DAI+Vehicle组，DAI造模后24h安乐死灌注取脑；HMGB1抑制剂甘草酸造模前30min通过尾静脉注射给药。采用Westcm-blot检测各组脑脊液中HMGB1水平以及炎症因子和CXCL12、CXCR4的表达；免疫组化检测中性粒细胞浸润；免疫荧光检测MBP表达；TUNEL染色检测神经细胞凋亡程度；电镜观察继发性脑损伤改变；EVANs评估血脑屏障通透性。 研究结果： 1）原代培养神经元在给予重组HMGB1干预后其CXCL12表达显著升高，并且具有剂量依赖效应；给予联合给予甘草酸后，重组HMGB1诱导CXCL12表达的作用被显著抑制。 2）DAI造模后动物的死亡率明显高于对照组，并出现中到重度的神经功能缺损，与对照组相比较评分差异有统计学意义；颅脑大体形态观察可见脑组织完整，无明显出血以及局灶性挫伤改变；TTC染色脑组织鲜红未见明显局灶性损伤，HE染色可见神经元肿胀、核固缩等坏死凋亡表现，此外还可见DAI后出现微血管破裂导致的微出血改变；PTAH染色显示DAI后神经轴突迂曲肿胀并伴有断裂；免疫组化染色可见DAI后β-APP在脑组织中大量蓄积提示轴突运输功能障碍；FITC标记的葡聚糖免疫荧光染色可见DAI后出现明显的血管外渗漏，提示DAI后血脑屏障破坏。上述结果均证实顺势旋转加速模型可引起典型的弥漫性轴索损伤病理改变。 3）Western blot结果显示DAI后早期脑损伤阶段，与对照组相比较，皮层脑组织内HMGB1表达在6、24h出现显著下降，48h开始逐渐升高，至DAI后72h基本升至正常水平；同时，脑脊液中HMGB1水平在DAI后则显著升高，提示DAI后存在HMGB1的大量释放进入脑脊液；DAI后脑组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9的表达水平也显著增高；轴索损伤相关蛋白p-tau和β-APP表达也显著增高；免疫荧光双标结果提示HMGB1蛋白主要在神经元细胞表达，基本不在星形胶质细胞表达，并且可以观察到HMGB1在DAI后存在明显的细胞外释放；TUNEL结果显示DAI后6h开始出现神经元凋亡，并且随着时间推移逐渐升高；DAI后脑组织匀浆中EVANS蓝含量明显相较于对照组明显升高，提示血脑屏障完整性破坏；免疫荧光结果显示DAI后脑组织中MBP的荧光强度显著下降，提示DAI后存在神经髓鞘降解；此外，脑含水量测定结果显示DAI后大鼠脑组织含水量相较于对照组显著升高，提示有脑水肿的发生。 4）Western blot结果显示DAI后脑组织内CXCL12/CXCR4表达水平相较于对照组显著上调，于24h达高峰；免疫荧光双标显示CXCL12主要表达于神经元，星形胶质细胞几乎无表达；免疫组化染色显示DAI后MPO和Neutrophil elastase阳性细胞数量增多，提示存在活化的中性粒细胞浸润，此外，DAI后脉络丛区域也存在大量MPO阳性细胞，脉络丛也是中性粒细胞浸润的主要途径。 5）HMGB1抑制剂甘草酸干预后，DAI后24h大鼠脑组织中炎症因子水平明显下降，同时CXCL12/CXCR4表达也显著降低，脑组织中MPO和Neutrophil elastase阳性细胞数量明显减少；甘草酸干预后，皮层神经元凋亡数量显著下降，MBP表达明显升高，脑水肿和血脑屏障破坏也显著减轻；同时电镜观察显示微管降解明显改善，同时线粒体损伤也明显减轻，神经功能评分明显降低，预后改善明显。 研究结论： 1）体外原代神经元培养提示HMGB1可显著诱导CXCL12的表达。 2）大鼠DAI损伤后脑组织存在明显的轴索损伤、微血管损伤、血脑屏障破坏以及神经细胞凋亡等继发性脑损伤，并且可引起明显的脑水肿和神经功能障碍。 3）DAI后早期脑损伤阶段，脑组织内HMGB1表达存在明显的动态变化，炎症因子表达明显升高，抑制HMGB1可显著降低DAI后脑组织炎症因子的表达，提示HMGB1在DAI后神经炎症反应中发挥着重要作用。 4）DAI后早期脑损伤阶段，脑组织内CXCL12/CXCR4的表达水平上调，同时损伤脑组织中出现明显的中性粒细胞浸润，抑制HMGB1可显著抑制CXCL12/CXCR4的表达，同时减少中性粒细胞浸润，提示HMGB1可能通过CXCL12/CXCR4通路参与诱导DAI后中性粒细胞浸润。 5）抑制HMGB1可显著减轻DAI后轴索损伤、髓鞘降解、脑组织水肿以及神经细胞凋亡等继发性脑损伤，提示HMGB1介导的神经炎症反应在DAI损伤中发挥着重要的作用。

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高迁移率组蛋白1 继发性脑损伤 弥漫性轴索损伤 神经炎症反应 中性粒细胞浸润

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摘 要 研究背景： 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种临床常见的中枢神经系统损伤，其治疗是当今医学界的一大难题。细胞移植疗法是现今SCI治疗的研究热点，其中，嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）因其促进SCI后神经再生和功能恢复，减轻继发性损伤的特点，以及可自体移植的特性，成为SCI细胞移植疗法中的热门移植细胞。弥散张量成像（diffusion tensor imaging，DTI）是一种基于水分子在三维空间中向各个方向弥散性能的差异而建立的功能磁共振成像。通过DTI参数及纤维束示踪成像技术，DTI扫描能够准确而敏感地反映SCI后神经纤维和髓鞘的变化，解释损伤后病理生理改变，是目前唯一一种能够无创反映活体脊髓神经纤维束形态结构的方法。近年来，DTI在SCI中的应用越来越多，然而DTI扫描尚未被用于评价OECs移植治疗SCI的疗效。OECs移植对SCI的治疗作用主要体现在两方面，即OECs分泌神经营养因子及细胞外基质的能力，以及移植的OECs本身的迁移能力和桥接作用。然而，OECs移植治疗SCI的疗效并不稳定，这很大程度上是由于SCI后产生的脊髓“有害”的微环境使得移植细胞难以长时间生存导致的。近年来，不少学者尝试使用干细胞上清液注射，利用其中富含的干细胞分泌物来治疗SCI。这种上清液疗法避免了移植细胞成瘤的危险，减轻了细胞移植后的免疫排斥反应，强化了细胞分泌物持续治疗的作用，取得了一定疗效。同样的，嗅鞘细胞也能分泌大量神经营养因子和细胞外基质，因此，嗅鞘细胞上清液疗法很可能对SCI有治疗作用。对此，之前尚无研究报道。 研究目的及意义： 1）通过细胞活性和纯度的鉴定，明确最适宜移植的原代OECs的培养时间。 2）通过行为学评分、影像学表现及组织学染色，验证OECs移植疗效，并首次尝试采用DTI扫描评价OECs移植疗效，探究DTI参数与OECs移植后大鼠运动功能恢复的关系。 3）首次尝试采用OECs上清液（OEC-M）腹腔注射治疗SCI，探究上清液注射后大鼠在行为学、影像学、组织学上的恢复情况，以及神经轴突再生和细胞自噬水平的变化。 4）采用DTI扫描评价OECs上清液治疗SCI的疗效，探究DTI参数与血清BDNF水平、大鼠运动功能恢复情况，脊髓损伤周围区域神经和轴突再生情况以及损伤节段细胞自噬水平的关系。 研究方法： 1）选用出生2d的SD大鼠乳鼠，以经典差速贴壁纯化培养法培养嗅球来源的原代OECs，通过细胞生长状态的观察和MTT实验测定细胞活性，P75NTR免疫荧光染色测定细胞纯度。在细胞活性和纯度均达到最佳时，制备细胞悬液以备移植使用，同时收集OECs上清液冻存备用。 2）以48只成年雄性SD大鼠为研究对象，使用NYU打击器建立标准大鼠SCI模型，1w后随机选取24只大鼠作为OECs移植组接受OECs移植，另外24只作为对照组。造模后每周进行BBB评分、常规磁共振扫描和DTI扫描，造模后2w、4w、6w和8w时，分别处死12只大鼠（每组6只）进行脊髓组织HE染色。通过Pearson相关性分析，探究DTI参数与OECs移植后大鼠BBB评分的之间的关系。 3）以108只成年雄性SD大鼠为研究对象，使用NYU打击器建立标准大鼠SCI模型。随机将大鼠分为对照组（36只，每天注射2ml Con-M）、低剂量OEC-M治疗组（36只，每天注射1ml Con-M+1ml OEC-M）和高剂量OEC-M治疗组（36只，每天注射2ml OEC-M）。造模后每3d进行一次BBB评分，每周随机选取18只大鼠（每组6只）进行常规磁共振扫描和DTI扫描。造模后1w、3w和6w时，分别处死36只大鼠（每组12只），收集心脏血液后进行灌注，采用ELISA测定血清中BDNF水平，并对脊髓组织进行HE染色、NF200和Beclin 1免疫组化染色，以Western blot测定脊髓组织Beclin 1蛋白表达水平。通过Pearson相关性分析，探究DTI参数与OECs上清液注射后SCI大鼠的BBB评分、血清BDNF水平、SCI周围组织NF200染色密度以及Beclin 1染色密度之间的关系。 研究结果： 1）MTT实验及细胞动态生长图表明，差速贴壁后培养至9d时的OECs细胞活性最佳，P75NTR免疫荧光测定此时OECs纯度达93±3.54%，因而这个时间点的OECs是最适合进行移植治疗的细胞。在差速贴壁后培养至8d和10d时的OECs细胞活性和细胞密度均较高，可收集其上清液已备后续实验使用。 2）所有大鼠SCI术后BBB评分均为0分，表明造模成功。OECs移植后大鼠BBB评分明显较对照组升高（P<0.05）。常规MRI的T1WI像和T2WI像均可见OECs移植后脊髓损伤区域较对照组逐渐缩小（P<0.05），脊髓继发性损伤受到抑制。脊髓组织HE染色表明OECs移植减轻了SCI初期炎性反应，促进损伤后期瘢痕修复。DTI扫描结果表明，在OECs移植后，FA值较对照组明显上升（P<0.05），ADC值较对照组明显下降（P<0.05）。通过FA图重建得到的FT图清晰展示了SCI区域的断裂的神经纤维束，且证实OECs移植减轻了脊髓受损区域的局部凹陷。通过相关性分析，可知DTI参数与BBB评分之间存在良好的相关性，其中，FA值与BBB评分呈线性正相关，ADC值与BBB评分呈线性负相关。 3）干预治疗后9d起，高剂量及低剂量OEC-M组大鼠BBB评分较对照组明显增高（P<0.05），在12d至30d时，高剂量组BBB评分明显高于低剂量组（P<0.05）。各组间大鼠血清的BDNF水平在各个时间点上均存在显著性差异（P<0.05），高剂量及低剂量OEC-M组的BDNF水平随着干预措施的延续显著性升高（P<0.05），而对照组则无显著性差异（P>0.05）。常规MRI的T1WI像和T2WI像均显示对照组的脊髓损伤范围在干预处理后逐渐向脊髓头端及尾端延伸，而OEC-M治疗组在干预处理后脊髓损伤范围得到了控制，甚至高剂量OEC-M治疗组的脊髓损伤范围逐渐减小。脊髓组织HE染色表明，OECs上清液注射后损伤区域的组织空腔较对照组明显减小，高剂量组在6w时出现明显的瘢痕修复。三组大鼠均未在脊髓损伤区域出现NF200阳性结构。而随着干预措施延续，在脊髓损伤周围区域，三组大鼠的NF200阳性神经细胞和轴突均逐渐增多。在干预治疗后1w、3w和6w时，OEC-M治疗组的NF200阳性密度均明显高于对照组（P<0.05），且高剂量组明显高于低剂量组（P<0.05）。SCI周围区域的Beclin 1染色密度，以及脊髓组织的Beclin 1蛋白表达水平均表明，三组大鼠的Beclin 1表达都随着时间推移逐渐下降，而在干预治疗后的各个时间点上，OEC-M治疗组的Beclin 1表达均明显高于对照组（P<0.05），且高剂量组明显高于低剂量组（P<0.05）。DTI扫描显示，干预治疗后三组大鼠的FA值逐渐上升，ADC值逐渐下降。自3w起，三组大鼠的FA值两两间出现显著性差异（P<0.05），且高剂量OEC-M治疗组的FA值最高。而ADC值自2w起，三组大鼠两两间出现显著性差异（P<0.05），且高剂量组最低。DTI扫描的FT图显示OEC-M治疗后脊髓局部凹陷减小。通过Pearson相关性分析，可知DTI参数与OEC-M注射后大鼠的BBB评分密切相关，且FA值与血清BDNF水平、SCI周围组织NF200染色密度以及Beclin 1染色密度之间存在良好的相关性。 研究结论： 1）差速贴壁后培养至9d时的OECs细胞活性及纯度最佳，最适用于细胞移植。 2）OECs移植能抑制SCI后的继发性损伤，促进运动功能恢复。DTI扫描（DTI参数及FT图）是评价OECs移植治疗脊髓损伤疗效的敏感指标，且DTI参数与OECs移植后的BBB评分密切相关，可作为评价OECs移植后运动功能恢复情况的可靠指标。 3）持续腹腔注射OECs上清液能够促进SCI后运动功能恢复，提高血清中神经营养因子水平，抑制SCI后继发性损伤，推动脊髓损伤周围区域神经和轴突再生并且增强损伤局部细胞自噬，这种新的基于OECs上清液的SCI治疗新方法对于SCI患者、基础研究工作者和临床医生都有很大意义。 4）DTI参数，尤其是FA值，能够准确而敏感地反映出OECs上清液治疗后大鼠运动功能恢复情况、脊髓损伤周围区域神经和轴突再生情况以及损伤节段细胞自噬情况，这些结果为DTI扫描的进一步应用提供了依据。

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脊髓损伤 弥散张量成像 上清液 神经再生 嗅鞘细胞

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摘 要 研究背景： 弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）是颅脑外伤的一种特殊类型，通常指头部在剪切应力的作用下出现的一种以轴索损伤为主要特征的原发性脑实质损伤，这种损伤主要弥漫分布于脑白质。临床上仍无治疗弥漫性轴索损伤的有效药物，主要原因是DAI后脑组织继发性改变的病理生理改变仍不明确，因此阐明DAI后脑组织的继发性病理改变及其潜在的分子机制，将有助于研发新的治疗DAI的药物，提高DAI的诊治水平。Toll样受体家族（Toll-like receptor；TLR）是一种模式识别受体家族，对TLR的早期研究主要集中在其识别病原体的相关分子模式，近年来越来越多的研究发现，TLR也可以识别损伤/危险相关分子模式，其可被多种分子识别并激活，在中枢神经系统的天然免疫和获得性免疫应答中起重要作用。Toll样受体2（Toll-like receptor 2；TLR2）是TLR家族中的一员。近年来，对包括神经横断损伤、脑出血、脑外伤、海马兴奋毒性等在内的CNS疾病的研究发现，TLR2在神经元死亡和组织损伤的过程中起重要作用。TLR2在脑外伤中的角色逐渐被发现。脑外伤后基因分析发现，TLR信号通路相关的基因表达发生动态变化。TLR2 表达明显升高，下游促炎因子及细胞间黏附分子明显上调。尽管TLR2在脑外伤的中的角色已有初步研究，但其在DAI中的作用尚未见研究。明确大鼠DAI后TLR2在脑组织中的时空表达变化，揭示TLR2在轴索损伤病理生理过程中的角色，可以为DAI的药物治疗提供新的靶点。 研究目的： 本研究通过瞬间旋转损伤装置建立大鼠DAI模型，模拟DAI后反应性胶质化及神经元损伤的病理生理过程，观察DAI后不同时间点、脑组织不同部位TLR2的表达情况，明确TLR2是否参与DAI后的病理过程，并通过与GFAP的表达进行相关性分析研究TLR2表达变化的意义，为进一步研究TLR2作为DAI的诊断及治疗靶点提供理论依据，为临床DAI后神经保护药物的提供研究基础。 研究方法： 采用大鼠头颅瞬间旋转装置制作大鼠DAI损伤模型，分为对照组和DAI组。利用免疫组化技术对大鼠脑组织切片进行染色，探讨DAI后不同时间点（6h，1d，3d，7d，14d）大鼠皮层、胼胝体、室管膜下区、内囊、丘脑、脑干等部位的TLR2的表达及变化规律，并将同一部位、同一时间点TLR2与GFAP的表达进行相关性分析，揭示TLR2在DAI损伤中可能的作用及机理，为DAI后继发性脑损伤及潜在生化标记物的探索提供研究基础。 研究结果： 1. DAI损伤后与对照组大鼠相比，DAI组皮层、胼胝体、室管膜下区、内囊、丘脑、脑干等部位GFAP的表达均显著升高（P<0.05）；GFAP是提示DAI损伤程度的标记物之一。 2. DAI损伤后与对照组大鼠相比，DAI组皮层、胼胝体、室管膜下区、内囊、丘脑、脑干等部位TLR2的表达均显著升高，伤后6h，TLR2的表达即开始增加，多是在伤后3d达到高峰，随后逐渐下降，至14d时各部位TLR2仍显著升高（P<0.05）；。 3. DAI后脑组织各部位GFAP与TLR2的表达呈显著相关性（P=0.00，Pearson相关系数r=0.63），TLR2可能是诊断DAI的标记物之一。 结论： TLR2在大鼠正常脑组织中有表达较少，DAI后脑组织皮层、胼胝体、室管膜下区、内囊、丘脑、脑干等部位TLR2的表达较对照组明显升高，它可能通过其表达的变化导致DAI后炎症反应的发生，从而进一步加重弥漫性轴索损伤后轴索的继发性损伤。TLR2与GFAP的表达及分布具有显著的相关性，提示TLR2可能也是一个潜在的DAI诊断生化标记物。

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GFAP TLR2 弥漫性轴索损伤

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研究背景： 脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCII） 是临床上常见的继发性损伤，其机制复杂、损伤严重，目前尚无确切有效的预防和治疗方法。激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system, KKS），包括缓激肽（bradykinin, BK）、缓激肽受体（bradykinin receptors, B1R & B2R）等成分，在中枢神经系统的大脑皮质、小脑、脑干、下丘脑、海马、松果体等部位的血管周围、神经元及胶质细胞上广泛表达，并且参与了脑卒中、阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫、多发性硬化症等多种中枢神经系统疾病的病理生理进程。在脑缺血再灌注损伤过程中，B1R和B2R表达增加，在损伤发生过程中发挥着重要的作用。然而，BK及其受体在SCII过程中的表达及作用尚不明确。 研究目的： 观察BK及其受体在大鼠SCII过程中的表达情况。 材料与方法： 1） 参照Zivin法使用夹闭肾下腹主动脉的方法构建Sprague-Dawley （SD）大鼠SCII动物模型； 2） 实验动物随机分为假手术组（sham组，n=15）、单纯缺血组（I组，n=15）和缺血再灌注组（IR组，n=105）。IR组又根据再灌注时间的不同分为IR3h、IR6h、IR12h、IR24h、IR48h、IR72h、IR5d组，每组15只； 3） 采用ELISA、免疫组化、免疫荧光、实时定量PCR等方法检测各组大鼠的血清BK浓度及脊髓组织中B1R和B2R的mRNA和蛋白表达水平。 研究结果： 1） 参照Zivin法夹闭肾下腹主动脉构建大鼠SCII模型后，大鼠的后肢运动功能评分明显降低，TTC染色显示缺血再灌注损伤节段主要在下腰段脊髓（L4~L6），HE染色可见神经元细胞结构破坏、细胞核固缩或溶解等病理变化； 2） 在SCII过程中，大鼠血清中的BK含量在缺血损伤末期即明显升高并维持到损伤后24h； 3） 在SCII过程中，大鼠脊髓组织中的B1R mRNA表达水平于再灌注3h后明显增高，之后迅速回降至大致正常水平并维持在正常水平附近；B2R mRNA表达水平在单纯缺血后明显下降，于再灌注3h后迅速升高至略高于正常水平，之后又迅速降低至低于正常的表达水平。相应地，B1R和B2R蛋白的表达水平在缺血损伤后明显下降，并于再灌注3h后表达增加。 4） 在SCII过程中，大鼠脊髓组织中的B1R和B2R主要表达在神经元和星形胶质细胞上。 研究结论： 1） 夹闭肾下腹主动脉的方法可以构建稳定可靠的大鼠SCII模型； 2） 在SCII过程中，大鼠血清中的BK含量增高，脊髓组织中的B1R 和B2R表达增加且主要表达在神经元和星形胶质细胞上。

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缓激肽 缓激肽受体 激肽释放酶-激肽系统 脊髓 缺血再灌注损伤

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背景： 脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤是指脑缺血后造成组织损伤，恢复血液灌注后损伤进一步加重，导致不同程度的结构损伤和功能障碍。脑I/R损伤发生在许多临床情况下，如心跳骤停、低血压、休克、出血、脑梗塞等。缺血一旦发生，恢复血流灌注是必需的治疗措施，但是再灌注损伤也给患者带来很大的影响。研究证实，I/R损伤是涉及多种因素的复杂病理过程，氧化应激损伤是先机因素，炎症反应与线粒体功能障碍为关键环节，Ca2+超载为细胞损伤的最后共同通路，血脑屏障的破坏和脑水肿为继发性损伤进程，而细胞凋亡是I/R损伤引起脑细胞死亡的中心机制，多种因素互相作用，互相影响。如何防治脑I/R损伤是处理心跳骤停等临床危急情况、降低患者致残率和致死率的重要措施。脑I/R后，细胞的坏死很快发生，而细胞凋亡发展至不可逆性损伤则需要一定的时间，这种时间的延迟性给临床治疗提供了潜在的治疗时机。目前，在实验中证明有效的一些药物在临床应用效果并不理想，寻找有效的药物或者防治措施是有关脑I/R损伤的研究热点。 槲皮素（quercetin, Que）属于黄酮类化合物，能够在蔬菜、水果、茶叶等植物中提取。由于其抗衰老、抗炎、抗氧化、改善内皮细胞功能等多种生物学活性，近年来在脏器保护方面受到人们的重视。许多研究发现其对心脏、肾脏、脑组织的损伤具有保护作用，在脑I/R损伤中的作用引起人们的关注。抗氧化作用是槲皮素神经保护的基础，更重要的是还可以作用于细胞内信号转导通路，促进抗氧化、抗炎及促生存蛋白的表达。磷脂酰肌醇-3激酶/丝/苏氨酸激酶（phosphoinositide-3 kinase/serine/threonine kinase, PI3K/Akt）信号转导通路是细胞内重要的信号转导通路，对细胞的生长、增殖、分化、代谢和存活起着重要的调节作用。槲皮素对脑I/R损伤的保护作用在体外实验和局灶性脑缺血模型得到了证实，对全脑I/R损伤的研究尚未见报道。进一步的研究表明槲皮素可以作用于PI3K/Akt通路，影响细胞的存活。但是槲皮素对脑I/R损伤的作用及其具体机制并不清楚。因此，我们建立全脑I/R模型，进一步观察槲皮素对全脑I/R损伤的作用，探索槲皮素减轻脑I/R损伤的具体作用靶点和分子机制，为临床防治脑I/R损伤提供实验依据。 第一部分 槲皮素对大鼠全脑缺血/再灌注损伤的保护作用 目的： 观察槲皮素对大鼠全脑I/R后神经行为学、血脑屏障以及海马CA1区组织形态的影响，初步评价槲皮素对大鼠全脑I/R损伤的保护作用。 方法： SD大鼠随机分为4组，分别为sham+vehicle组（S组）、I/R+vehicle组（I/R组）、I/R+Que 5mg/kg?d组（Q5组）及I/R+Que 10mg/kg?d组（Q10组）。采用四血管阻断（4-vessel occlusion, 4-VO）法建立全脑I/R损伤模型：采用10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，然后俯卧位固定，枕骨下正中切口，暴露第一颈椎横突翼小孔，烧灼双侧椎动脉，使其永久闭塞。24h后，大鼠麻醉后仰卧位固定，采用颈部正中切口，游离双侧颈总动脉，用无创微动脉夹夹闭，持续15min后开放动脉夹。S组仅仅予以暴露双侧椎动脉以及颈总动脉后缝合。Q5组和Q10组大鼠分别给予0.05%、0.1%的槲皮素溶液，S组和I/R组则给予等容量的溶剂，I/R前3d开始灌胃给药，每天1次，持续至观察结束。再灌注12h、24h和48h对各组大鼠进行神经功能缺陷（neurological deficit score, NDS）评分；再灌注第8天开始Morris水迷宫实验；再灌注12h、24h和48h检测脑含水量及Evan’蓝含量；HE染色观察海马CA1区再灌注24h组织病理学变化。 结果： 1.NDS评分结果显示，再灌注12h、24h和48h， I/R组大鼠的NDS评分较S组均有显著的下降（P＜0.05）；与I/R组相比，Q5组和Q10组的NDS评分均显著升高（P＜0.05）。 2.Morris水迷宫实验中，再灌注第8天、第9天和第10天，I/R组大鼠的逃避潜伏期较S组显著延长（P＜0.05），与I/R组比较，Q5 组和Q10 组的逃避潜伏期则显著缩短（P＜0.05）。空间搜索实验显示，I/R组大鼠在目标象限的游泳时间较S组显著缩短（P＜0.05），跨越平台原来位置次数也较S组显著减少（P＜0.05）。与I/R组比较，Q5组和Q10组大鼠在目标象限的游泳时间均显著延长（P＜0.05），跨越平台次数亦较I/R组有显著提高（P＜0.05）。 3.脑含水量检测结果显示，再灌注12h、24h和48h， I/R组大鼠脑含水量均显著高于S组（P＜0.05），在再灌注12h，Q5组和Q10组的脑含水量与I/R组相比无显著性差异（P＞0.05），而在24h、48h，与I/R组相比较，Q5组和Q10组的脑含水量显著降低（P＜0.05）。 4.EB含量的检测结果显示，再灌注12h、24h和48h， I/R组大鼠脑组织EB含量显著高于S组（P＜0.05），在再灌注12h，Q5组和Q10组的EB含量与I/R组相比无显著性差异（P＞0.05），而在24h、48h，与I/R组相比较，Q5组和Q10组EB含量显著降低（P＜0.05）。 5.HE染色结果显示，再灌注24h，S组海马CA1区结构清晰，细胞排列整齐，约3-4层，细胞质呈淡红色，核膜完整，核大而圆，呈蓝黑色，核仁清晰可见；IR组结构模糊，细胞排列紊乱，数目减少，胞体缩小，胞浆嗜酸性变，胞核皱缩，核仁消失。Q5组和Q10组病理学形态介于上述两组之间。 结论： 槲皮素（5mg/kg?d和10mg/kg?d）能够改善大鼠全脑I/R损伤后的神经功能缺陷，提高学习和记忆功能，抑制血脑屏障损伤和脑水肿，减轻组织损伤。 第二部分 槲皮素对大鼠全脑缺血/再灌注损伤后氧化应激、炎性因子以及细胞凋亡的影响 目的： 通过检测大鼠全脑I/R后海马ROS含量，IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ表达，细胞凋亡和凋亡相关蛋白的表达，观察槲皮素对氧化应激、炎性因子以及细胞凋亡的影响，探讨槲皮素减轻全脑I/R损伤的机制。 方法： SD大鼠随机分为4组：sham+vehicle组（S组）、I/R+vehicle组（I/R组）、I/R+Que 5mg/kg?d组（Q5组）及I/R+Que 10mg/kg?d组（Q10组）。采用4-VO法建立全脑I/R损伤模型，缺血时间为15min，S组暴露双侧椎动脉和颈总动脉后缝合。Q5组和Q10组分别给予0.05%、0.1%的槲皮素溶液，I/R组和S组则给予等容量的溶剂，I/R前3d开始灌胃给药，每天1次，持续至观察结束。再灌注相应时间点处死大鼠，抽取右心室静脉血，分离海马组织，DCFH-DA法检测大鼠海马细胞1h、12h、24h ROS含量；Real-time PCR法检测再灌注2h、12h、24h和48h海马组织IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ mRNA水平；ELISA法分别检测海马组织和血清IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ蛋白表达；再灌注24h，TUNEL法和AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测海马组织细胞凋亡；Western-blot法检测大鼠海马组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xl、survivin、cleaved caspase-3和p-Akt、p-Bad的表达。 结果： 1.DCFH-DA法检测ROS含量结果显示，再灌注1h、12h和24h，I/R组ROS含量显著高于S组（P＜0.05），再灌注1h和12h，Q5组和Q10组ROS含量均显著低于I/R组（P＜0.05），而在24h，Q5组的ROS含量和I/R组相比无显著性差异（P＞0.05），Q10组则显著低于I/R组（P＜0.05）。 2.Real-time PCR法检测结果显示，与S组相比，IL-1β mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA在再灌注2h、12h、24h和48h均显著升高（P＜0.05），Q5组IL-1β mRNA在48h，TNF-α mRNA在2h，IL-6 mRNA在2h、12h，与I/R组相比无显著性差异（P＞0.05），其余各时间点均较I/R组显著降低（P＜0.05），Q10组IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA在各时间点均较I/R组显著降低（P＜0.05）。再灌注2h、12h，各组IFN-γ mRNA水平无显著性差异（P＞0.05），再灌注24h、48h，与S组相比，I/R组IFN-γ mRNA水平显著升高（P＜0.05），与I/R组比，Q5组和Q10组IFN-γ mRNA水平均显著降低（P＜0.05）。 3.ELISA法检测结果显示，在脑组织和血清中，与S组相比，I/R组IL-1β、TNF-α和IL-6在再灌注2h、12h、24h和48h均显著升高（P＜0.05），与I/R组相比，Q5组和Q10组IL-1β、TNF-α和IL-6在再灌注各时间点表达显著降低（P＜0.05）。再灌注2h、12h，各组IFN-γ的表达水平无显著性差异（P＞0.05），在24h、48h，I/R组IFN-γ的表达显著高于S组（P＜0.05），而Q5组和Q10组IFN-γ的表达则显著低于I/R组（P＜0.05）。 4.TUNEL结果显示，S组基本无凋亡阳性细胞，I/R组可见大量凋亡阳性细胞， Q5组和Q10组则可见少量凋亡阳性细胞。 5.AnnexinⅤ/PI双染流式细胞仪检测结果显示，I/R组凋亡细胞比例较S组显著增加（P＜0.05），Q5组和Q10组凋亡细胞比例较I/R组显著降低（P＜0.05）。 6.Western blot 法检测结果显示，再灌注24h，与S组相比，I/R组Bcl-2的表达显著升高（P＜0.05），Bcl-xl无显著性差异（P＞0.05），survivin的表达显著降低（P＜0.05），cleaved caspase-3表达显著升高（P＜0.05），而与I/R组相比，Q5组和Q10组Bcl-2、Bcl-xl和survivin表达均显著升高（P＜0.05），cleaved caspase-3表达则显著降低（P＜0.05）。与S组相比，I/R组p-Akt、p-Bad表达无显著性差异（P＞0.05），与I/R组相比，Q5组和Q10组p-Akt、p-Bad表达则显著升高（P＜0.05）。 结论： 槲皮素（5mg/kg?d和10mg/kg?d）通过减少ROS生成，抑制氧化应激；抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表达而抑制炎症反应；上调p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bcl-xl、survivin的表达，下调cleaved caspase-3的表达，抑制细胞凋亡，保护全脑I/R损伤。 第三部分 槲皮素保护全脑缺血/灌注损伤的作用与PI3K/Akt信号通路的关系 目的： 通过检测大鼠全脑I/R后PI3K/Akt通路相关蛋白的表达；并通过抑制PI3K/Akt通路，观察槲皮素对海马ROS含量、细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响，进一步探索槲皮素保护全脑I/R损伤的作用机制。 方法： LY294002是一种常用的PI3K抑制剂，能够通透细胞，特异性地抑制PI3K，抑制PI3K/Akt信号途径以及Akt的磷酸化等。为了证实PI3K/Akt信号通路在槲皮素保护全脑I/R损伤中的作用，我们使用LY294002进行验证。 SD大鼠随机分为3组：I/R+LY294002组（I/R组），I/R+Que 10mg/kg?d组（Q组）及I/R+Que 10mg/kg?d/LY294002组（Q/L组）。采用4-VO法建立全脑I/R损伤模型，缺血时间为15min。I/R组、Q组和Q/L组分别以等容量的溶剂、0.1%的槲皮素溶液和0.1%的槲皮素溶液灌胃，造模前3天开始，每天1次，持续至观察结束。在首次灌胃前2h，I/R组、Q组和Q/L组分别脑室内注射10μl的LY294002、溶剂和LY294002。LY294002脑室内注射具体方法：大鼠麻醉后，置入固定装置，前囟保持水平，切开头皮，在前囟后0.8mm，向左旁开1.4mm，深度为3.6mm，用微量注射器以1μl/min的速度向侧脑室注射10μl LY294002。再灌注后24h，处死大鼠，分离海马组织，Western blot法检测p-Akt、p-Bad、Bcl-2、cleave caspase-3和Nrf2的表达；TUNEL法检测CA1区凋亡细胞，DCFH-DA法检测海马细胞ROS含量。 结果： 1.Western blot检测结果显示，与I/R组相比，Q组p-Akt、p-Bad、Bcl-2表达显著升高（P＜0.05），cleaved caspase-3表达显著降低（P＜0.05），与Q组相比，Q/L组p-Akt、p-Bad、Bcl-2表达显著降低（P＜0.05），而cleaved caspase-3表达显著增加（P＜0.05）； 2.TUNEL检测结果显示，I/R组可见大量凋亡阳性细胞，Q组仅见少量阳性凋亡细胞，Q/L组凋亡阳性细胞则较多。 3.DCFH-DA法检测结果显示，与I/R组相比，Q组ROS含量显著降低（P＜0.05），与Q组相比，Q/L组ROS含量则显著升高（P＜0.05）。 4.Western blot检测结果显示，与I/R组相比，Q组胞核Nrf2表达显著升高（P＜0.05），而胞浆Nrf2表达显著降低（P＜0.05），与Q组相比，Q/L组胞核Nrf2表达显著降低（P＜0.05），而胞浆Nrf2表达显著升高（P＜0.05）。 结论： 槲皮素通过激活PI3K/Akt通路，增加Akt和Bad的磷酸化，上调Bcl-2的表达，抑制cleaved caspase-3的表达，抑制细胞凋亡；促进Nrf2的核转位，抑制细胞内的ROS生成，实现对全脑I/R损伤的保护作用。

Keyword ：

凋亡 槲皮素 磷脂酰肌醇-3激酶/丝/苏氨酸激酶 脑缺血/再灌注

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