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目的:免疫荧光染色(ImmunofluorescenceStaining, IF)是进行视网膜研究的重要方法之一。为了获得最优的IF结果,我们对视网膜的固定方法进行优化。方法:以小鼠视网膜为观察对象,分别采用浸泡固定方法(Immersion, I)、灌注法(Perfusion, P)以及两者联合(I+P)的方法进行固定,以IF方法对Pax6和Rhodopsin等抗原进行染色,对比各组视网膜组织的IF染色效果。其中,具体分组包括:浸泡固定2小时组(I2),浸泡固定12小时组(I12),浸泡固定24小时组(I24),灌注组(P),灌注+浸泡后固定2小时组(P+I2),灌注+浸泡后固定12小时组(P+I12)。结果:从大体结构来看,P+I2组的固定良好率达100%,I12、I24、P+I12组的良好率达83.33%,I2组和P组较低,分别是16.67%和0%。从Pax6的IF染色来看,I12组的染色满意度达100%,P+I2组和P+I12组的满意度为83.33%,I2组、I24组和P组的满意度较低,为16.67%。从Rhodopsin的IF染色结果来看,P+I2组和P+I12组的染色满意度为83.33%,I24组为50%,I2组、I12组和P组都为0%。P+I12组的视网膜切片行NF-M、PKC-α和glutamine synthetase (GS)染色也可获得良好的阳性结果。结论:综合大体结构、Pax6染色以及Rhodopsin染色等结果,P+I2组和P+I12组的效果最好,视网膜组织结构完整,IF方法行Pax6和Rhodopsin等的染色效果良好。因此,针对小鼠的神经视网膜进行IF相关实验时,灌注结合浸泡后固定2至12小时,可以作为最优的组织固定方法。

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PAX6 RHODOPSIN 固定方法 免疫荧光染色 视网膜 小鼠

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采用动态灌注法制备氧化还原石墨烯(RGO)/聚乙二醇(PEG)复配成核剂,再利用双螺杆挤出机熔融共混制备一系列RGO/PEG改性PLA复合材料;并在模拟湿热环境下进行老化实验,再利用SEM、WAXD、DSC、POM和万能试验机对老化前后试样的断面形貌、结晶及力学性能进行测试分析。结果表明,RGO/PEG含量在0. 5%时,PLA基复合材料的断面更为粗糙,裂纹深度增加;经老化处理后,PLA基复合材料的界面呈现出模糊的交联结构。老化前,RGO/PEG含量在0. 5%时,PLA基复合材料的结晶度(X_c)达到最大值29. 4%,比纯PLA提高了18. 89%;其拉伸强度达到59. 45 MPa,比纯PLA的增加了6. 88%。与未老化的相比,老化处理后的PLA基复合材料的Xc均有所提高;而RGO/PEG含量为0. 5%的PLA基复合材料经老化处理后拉伸强度为59. 98 MPa,比老化后的纯PLA提高了1. 9%。

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结晶度 聚乳酸 聚乙二醇 湿热老化 氧化还原石墨烯

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目的 探讨大鼠急性视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)后不同时间点视网膜中副凋亡及自噬的发生.方法 将30只健康成年SD雄性大鼠随机分为RIRI组及正常对照组.利用高眼压前房灌注法建立SD大鼠急性RIRI动物模型.正常对照组不做任何处理.急性RIRI后1d、3d、7d、28 d各时间点取各组大鼠的视网膜组织,利用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)副凋亡及自噬的发生;利用免疫荧光染色法检测视网膜微管相关蛋白1轻链3 (microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达.结果 急性RIRI后1d持续至28 d,TEM可见RGCs细胞质空泡数量较正常对照组增高.急性RIRI后1d持续至28d,TEM可见RGCs细胞质中自噬体数量增加.正常对照组RGCs的细胞质中自噬体每50 μm2平均为0.79个,急性RIRI后7d自噬体的平均数量达到高峰,每50 μm2平均为2.29个,与正常对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).免疫荧光法检测发现,与正常对照组相比,急性RIRI后1d开始,RGCs的细胞质中LC3表达增加,并在整个实验期间持续高表达,正常对照组RGCs层的LC3阳性细胞百分比为15.90％,急性RIRI后1d、28 d时LC3阳性细胞百分比分别为46.95％和52.30％,与正常对照组相比差异均具有统计学意义(均为P ＜0.05).结论 急性RIRI后RGCs涉及副凋亡和自噬的激活,各种类型的程序性细胞死亡可作为单一细胞死亡的形式或多种细胞死亡形式共存,参与急性RIRI视网膜损伤.

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副凋亡 视网膜缺血再灌注损伤 视网膜神经节细胞 自噬

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目的:观察急性高眼压后不同时间点大鼠视网膜神经节细胞中自噬及副凋亡的发生,并探讨其机制.方法:将50只健康成年SD雄性大鼠随机分为正常对照组、急性IOP损伤3d,1、4、8wk组.利用高眼压(elevated intraocularpressure,IOP)前房灌注法建立SD大鼠急性IOP损伤模型,取各组大鼠的视网膜组织,采用免疫荧光染色法检测视网膜微管相关蛋白1轻链3 (microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达;利用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)细胞质中自噬体及胞质空泡的产生,验证自噬及副凋亡的发生.结果:透射电镜观察可见大鼠RGCs细胞质中包裹着电子致密物的双层或多层膜的自噬泡,正常对照组、急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组,RGCs细胞质中每50μm2自噬泡数量分别为0.79±0.43、2.14±0.36、2.29±0.47、1.57±0.51、1.21±0.43个,急性IOP损伤后各组大鼠RGCs内每50 μm2自噬泡数量均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).正常对照组视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)仅见少量LC3阳性表达,LC3阳性细胞百分比15.90％.急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠GCL中LC3阳性细胞百分比均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠每200μm内RGCs数量较正常对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).急性IOP后3d持续至8wk透射电镜观察可见大量由线粒体和/或内质网肿胀形成的细胞质空泡.结论:急性IOP损伤后RGCs涉及自噬和副凋亡的激活,各种类型的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)可作为单一细胞死亡的形式或多种细胞死亡形式共存,参与急性IOP后视网膜神经节细胞的损伤.

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副凋亡 急性高眼压 视网膜神经节细胞 自噬

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目的 体外构建基于脾脏脱细胞支架的组织工程肝脏,并探索其理想的体内植入策略.方法 获取健康SD大鼠脾脏,采用低温冻融结合十二烷基硫酸钠灌注法制备脾脏脱细胞支架(DSM).Seglen改良两步胶原酶灌注法获取大鼠原代肝细胞,经脾动脉再植入DSM内体外构建组织工程肝脏.以SD大鼠为受体,比较异位血管吻合移植、肝断面缝合移植、肝内嵌入移植以及肠系膜包裹移植4种策略的优缺点.结果 肝细胞支架种植率为(74.5±7.7)％,HE染色与扫描电镜显示细胞状态良好,免疫荧光染色证实细胞正常表达ALB、G6Pc.异位血管吻合移植手术难度高,围手术期死亡率高达33.3％,术后6h支架内形成大量血栓;肝断面缝合无法迅速建立充分血供,术后3d未见成形移植物;肝内嵌入移植法细胞最长可存活14d;肠系膜包裹移植术后14d时支架内细胞存活率为(38.3±7.1)％.结论 利用DSM构建的组织工程肝脏能部分表达肝细胞特异性功能,肠系膜包裹移植策略简单安全有效,是目前可行的体内移植方式.

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脾脏脱细胞支架 体内植入 组织工程肝脏

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摘 要 研究背景： 急性脑梗死患者用重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA）溶栓后最常见，最危险的并发症是出血性转化（hemorrhagic transformation，HT），能影响预后，严重者可直接致死，且目前尚缺乏有效的预防措施。此外，出血性转化也是限制溶栓时间窗的主要危险因素。如何减少HT的发生率和严重程度是增加rt-PA溶栓安全性的关键。急性脑梗死后，尤其是rt-PA溶栓后，基质金属蛋白酶9（MMP-9）过度表达，过量的MMP-9降解细胞外基质，导致血脑屏障完整性的破坏是发生HT的基础之一。因此，如何降低rt-PA溶栓后MMP-9的过量表达是减少HT发生率和严重程度的关键。受体相关蛋白（receptor associated protein, RAP）是低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1）的特异性抑制剂，能特异性拮抗LRP-1的生物活性。而LRP-1不仅是MMP-9和TIMP-1的配体，也是t-PA的配体，因此，理论上拮抗LRP-1的活性能阻断t-PA对MMP-9表达的促进作用，但至今未见相关报道。本研究旨在阐述，RAP联合rt-PA溶栓对增加rt-PA溶栓安全性的作用，为急性脑梗死的治疗提供新的思路。 研究方法： 采用自体血栓法制作SD大鼠大脑中动脉闭塞模型。大鼠分成假手术组，生理盐水（NS）组，rt-PA+RAP联合溶栓组和rt-PA单独溶栓组。除假手术组外，其余大鼠均行自体血栓栓塞术，术中注入10枚长约2mm，直径约0.3mm的血栓，而假手术组则行相同的手术过程但不注入栓子，只注入等体积的PBS。模型完成后取脑行HE染色，观察急性脑梗死后不同部位的病理变化，并评价模型成功率，同时行LRP-1免疫组化染色，观察急性脑梗死后LRP-1的表达。用TTC染色观察脑梗死面积，用FITC-dextran灌注法观察血管再通情况，用激光多普勒血流仪观察不同时段的血流情况，用组织氧分压仪观察局部组织的血氧恢复情况，用动静脉血气分析法分析组织的代谢活性，以上指标用于研究rt-PA联合RAP溶栓对溶栓效率的影响。用大鼠脑组织血红蛋白定量法定量HT的严重程度，用伊文思蓝渗漏法定量血脑屏障的破坏程度，用mNSS评分评价大鼠的神经功能缺损程度，以上指标用于检测rt-PA联合RAP溶栓对增加溶栓安全性的作用。大鼠取脑后匀浆，提取蛋白和mRNA后，用Western blot法，real-time PCR法，明胶酶谱和反向明胶酶谱法分别定量MMP-9和TIMP-1的蛋白表达量、mRNA表达量和活性。此外，我们还研究了，大鼠的生存期，活动能力和体重变化曲线，用于探索RAP联合rt-PA溶栓对大鼠长期预后的影响。数据用SPSS 19.0统计软件分析，结果用 ±s表示，同一组数据间采用单因素方差分析，不同时间点结果与基础组对照用Dunnett-t检验，两两比较采用LSD检验。 结果： SD大鼠行自体血栓栓塞模型后出现了明显的病理生理改变，且在血管内可见梗塞的血栓，提示该模型稳定可靠，且能用于溶栓研究。LRP-1正常脑组织中呈低表达，但在梗死区内的表达量明显增加。用RAP联合rt-PA溶栓相比rt-PA单独溶栓能明显减少梗死面积，并在能更早期快速使血流复通，但不影响梗死半球血流的远期恢复程度。以上结果提示RAP能增加rt-PA的溶栓效率。RAP联合rt-PA溶栓能明显减少出血性转化的严重程度，减少伊文思蓝的渗漏，并改善脑梗死大鼠的神经功能缺损程度，提示RAP能增加rt-PA溶栓的安全性。进一步研究提示，rt-PA溶栓后MMP-9的表达量明显增加，但TIMP-1的表达量增加不显著，导致MMP-9/TIMP-1的比值失衡，同时rt-PA也能增加MMP-9的活性。RAP与rt-PA联合溶栓后能显著减少MMP-9的表达量，并增加TIMP-1的表达，同时也能减少MMP-9的活性，并增加TIMP-1的活性。RAP联合rt-PA溶栓还能较rt-PA单独溶栓，显著增加大鼠的长期生存时间，加快大鼠的体重恢复速度并改善大鼠的运动能力。 结论： 1）急性脑梗死后，梗死区脑组织内LRP-1的表达量显著增加；2）RAP联合rt-PA溶栓能增加rt-PA的溶栓效率；3）RAP联合rt-PA溶栓能减少由rt-PA导致的出血性转化的严重程度，增加溶栓安全性；4）RAP能中和由rt-PA导致的MMP-9/TIMP-1比值失衡，并减少MMP-9的活性；5）RAP联合rt-PA溶栓能增加大鼠的长期预后。

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出血性转化 低密度脂蛋白受体相关蛋白1 脑梗死 受体相关蛋白

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常温 肝移植 机械灌注 无血氧合 心脏死亡器官捐献

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背景与目的： 肿瘤的生长是新生血管依赖性的， 瘤体的持续增大需要新生血管来维系营养供给和排泄代谢产物。与生理性血管生成不同的是，肿瘤的血管生成多是失调控的，表现为促血管生成因子与抗血管生成因子稳态失衡与血管重构。传统抗肿瘤血管生成治疗是通过抑制促血管生成因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），破坏肿瘤血管新生进而来抑制肿瘤生长。然而，临床研究表明抗血管生成 (Anti-angiogenesis) 单药治疗并不能使肿瘤明显缩小、延长肿瘤患者的生存期；而抗血管生成药物与化疗联用通常是一种有效的治疗方案，其疗效优于单用化疗。针对这一临床问题，近年来有学者对通过抑制肿瘤血管生长而“饿死”肿瘤的抗血管生成疗法产生了质疑，而合理运用抗血管生成药物在一定时间内增加了肿瘤血供、提高了化疗药物递送的“肿瘤血管正常化”观点逐渐被认可。该理论的提出较抗肿瘤血管生成传统观念晚了30余年。肿瘤血管正常化是通过对结构和功能异常的肿瘤血管进行修复，改善肿瘤微环境，从而抑制肿瘤的生长和转移，更有效地输送氧气和药物到达肿瘤组织，提高化疗和放疗的治疗效果。肿瘤血管正常化是当前肿瘤治疗及再生医学领域的研究热点，是对抗肿瘤血管治疗的全新阐述和进一步延伸，具有广阔的临床应用前景。然而如何探索有效的致肿瘤血管正常化药物及将其成功应用于临床仍存在很大挑战。沙利度胺（Thalidomide) 属镇静安眠类药物，曾用于治疗妊娠期呕吐，但因其严重的致畸作用而于20世纪60年代初撤出市场。近年来一系列体外和体内实验研究发现其具有抗血管生成和免疫调节作用，尤以其影响血管生成为主的抗肿瘤作用而被日益重视。沙利度胺抗肿瘤血管生成的机制目前仍不是很明确, 有动物实验证实沙利度胺可以减少肉芽组织的血管密度，对由血管内皮生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱发的血管生成有很强的抑制作用。此外，另有研究表明沙利度胺可通过上调血小板衍生生长因子（PDGF-β）招募周细胞促进血管成熟，从而使遗传性毛细血管扩张症患者鼻出血症状显著改善。据此，我们推测沙利度胺对肿瘤血管同样具有促正常化作用，若与细胞毒性药物联合使用可有望提高其敏感性。为了验证该假设，本研究选取沙利度胺做为候选药物，旨在观察并明确沙利度胺持续作用于多种小鼠肿瘤模型时是否可诱发肿瘤微血管正常化效应、作用不同时间后肿瘤血管结构、功能及肿瘤微环境的变化，并对其可能的机制进行初步的研究。此外，进一步联合化疗药物评价其抑瘤效应，以期为其在临床中的进一步应用提供有价值的理论依据及新的思路。 实验方法： 1. 构建4T1小鼠乳腺癌原位移植瘤模型，将荷瘤鼠随机予以羧甲基纤维素钠溶液（溶媒，0.1 ml/ kg?d，ip）、低剂量沙利度胺（100mg/kg?d，ip）及高剂量沙利度胺（200mg/kg?d，ip）处理，分别在给药第5、第9天动态检测各组以下指标：（1）血管结构改变：取瘤，冰冻切片，免疫荧光双标CD31/α-SMA动态观察微血管结构，计数微血管密度 (CD31-MVD)、周细胞覆盖率；（2）血管功能改变：小鼠尾静脉注射生物素化-Lectin，取瘤，冰冻切片，免疫标记CD31/Lectin动态检测微血管灌注功能变化，伊文思蓝灌注法评价血管壁通透性改变；（3）肿瘤微环境改变：石蜡切片，免疫组化法检测HIF-lα、H&E染色分别评价对照组及沙利度胺组肿瘤组织乏氧及坏死变化情况。 采取同样方法在CT26小鼠直肠癌原位移植瘤模型中对200mg/kg?d的沙利度胺促血管结构与功能正常化作用进行验证。 2. 培养正常人脐带静脉内皮细胞，调整适当细胞浓度后与基质胶共孵育建立二维培养小管形成体系，倒置显微镜下观察经不同浓度沙利度胺（10-2 ~ 10-1 mg/ml）作用后的成管能力。 3. 取肿瘤微血管结构及功能变化最显著的时间点的4T1肿瘤组织，提取组织蛋白，BCA法常规蛋白定量，抗体芯片法检测53种血管生成因子变化情况。 4. MTT法分别检测沙利度胺单药及联合表阿霉素对4T1细胞增殖能力的影响； 5. 建立 4T1小鼠乳腺癌原位移植瘤模型，随机分为4组：对照组（0.5%羧甲基纤维素钠 0.1 ml/ kg?d， d1-14），沙利度胺单药组 (200mg/kg?d，ip)；表阿霉素单药组(2mg/kg?d，ip)；联合给药组（沙利度胺200mg/kg?d +表阿霉素2mg/kg?d，ip）。测量肿瘤体积变化，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。 结果： 1. 沙利度胺在体内外对内皮细胞的影响 体内实验表明100mg/kg?d和200mg/kg?d的沙利度胺均可显著降低4T1肿瘤组织中CD31的表达，微血管密度较对照组均显著下降（P<0.001）。二维基质胶网状毛细血管形成实验表明, 与对照组相比, 沙利度胺可明显抑制人脐静脉内皮细胞体外小管形成能力，所形成小管结构松散 、不完整，且存在明显的剂量-效应关系。 2. 沙利度胺对肿瘤血管结构及功能的影响 在4T1小鼠乳腺癌模型中不同剂量沙利度胺作用后肿瘤血管与结构的演变情况：（1）血管结构：与对照组相比，100mg/kg?d和200mg/kg?d的沙利度胺均可使周细胞覆盖率（CD31+/α-SMA+所占比例）显著升高（P<0.001），并随剂量的增大及作用时间的延长，周细胞覆盖率逐渐提高，表现出一定的剂量-效应与时间-效应关系；（2）血管功能：经100mg/kg?d和200mg/kg?d的沙利度胺干预后血管灌注功能（CD31+/Lectin+所占比例）较对照组显著增强（P<0.001），并表现出一定的剂量-效应与时间-效应关系。体内血管通透性实验表明，100mg/kg?d和200mg/kg?d的沙利度胺均可显著降低肿瘤组织中依文思蓝染料含量 (P<0.001)，高剂量沙利度胺作用更明显。此外，在 CT26小鼠直肠癌模型中均观察到了沙利度胺（200mg/kg?d）的促肿瘤血管正常化作用，具体表现为：周细胞覆盖率及血管灌注功能显著提高，与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。 3. 沙利度胺对肿瘤微环境的影响 在小鼠4T1乳腺癌模型中，免疫组化法对HIF-lα染色结果提示沙利度胺可显著降低肿瘤组织缺氧程度（P<0.05），H&E染色显示沙利度胺作用后肿瘤组织坏死面积显著降低（P<0.05）。 4. 沙利度胺促肿瘤血管正常化可能的作用机制 抗体芯片结果显示沙利度胺可明显降低Amphiregulin、Angiogenin、Tissue Factor、CXCL16、Cyr61、Endoglin、Endothelin-1、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IL-1α、CXCL10、MCP-1、MIP-1α、MMP-8、PEDF、TIMP-1的表达，而使PDGF-AA、PDGF-BB的表达升高，提示沙利度胺诱发肿瘤血管正常化可能的作用机制是通过建立促血管生成因子和抑血管生成因子间的平衡。 5. 沙利度胺体内外联合细胞毒性药物的抗肿瘤作用 沙利度胺在体外联合表阿霉素无显著的协同作用（CDI=0.98，P>0.05）；在荷4T1小鼠体内沙利度胺与表阿霉素联合使用具有明显的协同作用，联合用药抑瘤率显著增加（P<0.05）。 结论：沙利度胺可诱导肿瘤血管结构及功能趋于正常化并增强细胞毒性药物的抗肿瘤疗效。 关 键 词：沙利度胺；肿瘤血管正常化；抗血管生成；肿瘤微环境

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抗血管生成 沙利度胺 肿瘤微环境 肿瘤血管正常化

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背景： 青光眼是与脑内视觉区域相关的中枢神经系统变性疾病，但其涉及视觉中枢损伤的潜在机制仍不明确，近年来，人们对青光眼病理性改变的认识除了机械敏感性缺血外也关注到炎症反应。参与青光眼视网膜损伤的炎症反应是否同时参与了青光眼发生后视觉中枢的神经元损伤，炎症反应与视觉中枢的胶质活化的关系也有待于进一步证明。青光眼视觉中枢损伤机制的研究，为青光眼视神经保护提供策略。 目的： 青光眼是涉及整条视路的中枢神经系统变性性疾病的角度出发，研究青光眼视网膜及视中枢的神经元变性涉及的程序性细胞死亡的类型、星型胶质细胞胶质活化、p38 MAPK及NF-κB信号通路激活在青光眼视路损伤中的作用，探寻青光眼视网膜及视觉中枢神经保护效应靶点。 方法： 1）利用高眼压前房灌注法建立SD大鼠急性高眼压RIR损伤模型，随机分为RIR损伤组、假手术组及正常对照组；高眼压RIR损伤后6 h，12 h，24 h，3 d，7 d各时间点取各组大鼠的视网膜组织，利用免疫荧光染色法检测视网膜LC3的表达；利用透射电镜检测RGCs自噬及副凋亡的发生。 2）利用高眼压前房灌注法建立SD大鼠急性高眼压RIR损伤模型，随机分为RIR损伤组、假手术组及正常对照组；高眼压RIR损伤后3 d，1 w，2 w，4 w，8 w各时间点取各组大鼠含LGN、SC的脑组织，利用尼氏染色检测LGN、SC神经元横截面积及数量的变化，检测LGN、SC神经元变性的发生。 3）急性高眼压RIR损伤后，利用透射电镜检测LGN、SC神经元副凋亡的发生，证实非凋亡性程序性细胞死亡参与LGN、SC的跨神经元变性。 4）利用TUNEL法检测LGN、SC凋亡的发生；利用免疫荧光染色法检测LGN、SC的GFAP表达，证实急性高眼压RIR后星型胶质细胞在LGN、SC的活化。 5）利用Western blotting检测LGN、SC的p38 MAPK通路总蛋白及磷酸化水平，探讨急性高眼压RIR导致LGN、SC的p38 MAPK信号通路的活化参与LGN、SC的跨神经元变性及星型胶质细胞活化的可能机制。 6）利用免疫荧光染色法检测NF-κB p65的核转位，Western blotting定量检测NF-κB p65的蛋白表达，分析急性高眼压RIR导致NF-κB信号通路的活化参与LGN、SC的跨神经元变性及星型胶质细胞活化的可能机制；分析p38 MAPK对NF-κB活化可能的信号机制。 结果： 1）急性高眼压RIR损伤后不同时间点（6 h，12 h，24 h，3 d，7 d），透射电镜观察可见RGCs细胞质中自噬泡数量的急剧增加，于RIR后6 h出现自噬体激活增加并在整个实验期持续激活；自噬体为双层或多层膜空泡，包裹电子致密物、致密非结晶内容物或膜状螺旋小体。正常对照组RGCs的细胞质中自噬泡的平均数量≈0.79/50 μm2，RIR后7d自噬体的平均数量≈2.29/50 μm 2，较正常对照组显著增高（P<0.05）；RIR损伤造成RGCs自噬的激活。 2）免疫荧光法检测发现，正常对照组LC3在GCL和IPL有极少量表达。LC3免疫反应性在高眼压RIR后6 h的GCL和IPL显著增加，表现为小簇状、致密染色颗粒；RIR后3 d后IPL的LC3免疫反应性降低，RGCs的细胞质中LC3表达增加，并在整个实验期间持续高表达；与正常对照组相比，RIR损伤后7 d ，GCL的DAPI阳性细胞的平均数量从26.2±1.92个下降至16.4±1.67个，且IPL和INL的厚度在7 d也显着下降，这反映了视网膜内层结构的破坏；RIR损伤造成RGCs胞质自噬的显著激活并与RGC死亡的时期相一致。 3）透射电镜观察发现急性高眼压RIR诱导RGCs细胞质中副凋亡的发生。副凋亡的典型特征是细胞质空泡化，空泡内清晰且无细胞质由内质网和/或线粒体肿胀形成，可见线粒体嵴出现扩张。于RIR后6 h出现胞质空泡化数量增加且持续到RIR损伤后7 d。定量分析结果表明，正常对照组RGCs细胞质空泡的数量平均≈2.27/10 μm2，而RIR损伤后6 h胞质空泡化数量显著增加并达到峰值≈6.7/10 μm2；RIR损伤诱导的RGCs死亡部分通过副凋亡，RIR损伤导致细胞器的肿胀可能提示细胞内环境稳态的破坏。 4）透射电镜观察发现高眼压RIR损伤后3 d，1 w，2 w，4 w，8 w各时间对侧LGN、SC神经元发生副凋亡。正常对照组大鼠LGN、SC神经元胞质中神经元偶见或不见核周出现的胞内空泡，线粒体、内质网超微结构清晰，核大而圆，有明显核仁且核内染色质分布均匀；高眼压RIR损伤后3 d对侧LGN、SC的神经元胞浆开始出现空泡化，当再灌注时间的延长，对侧LGN、SC的神经元胞质空泡化持续出现。胞质空泡由内质网和/或线粒体渐进性肿胀形成，空泡内不含细胞器等内容物，双层膜空泡内可见少量线粒体嵴并扩张；在观察期内未见对侧的LGN、SC神经元出现明显的坏死状形态，细胞自噬和凋亡。因此，急性高眼压RIR损伤诱导的对侧LGN、SC神经元的死亡部分通过副凋亡，急性高眼压RIR损伤导致细胞器的肿胀可能提示细胞内环境稳态的破坏。 5）细胞密度和尺寸的变化是组织应力引起的形态学变化的重要指标。急性高眼压RIR后对侧dLGN、SC神经元逐渐固缩，这个趋势从术后1 w持续到术后8 w。同侧用于在各时间点与对侧对比。正常对照组双侧dLGN、SC神经元大小未见明显差异。与正常对照组相比，术后1 w对侧dLGN神经元横截面积从79.12±5.83 μm2下降至69.75±1.84 μm2，约减少了11.8%，而术后8 w对侧dLGN神经元横截面积约减少了21.4% （62.17±2.09 μm2）；对侧dLGN的细胞密度增多，术后3 d，1 w，2 w，4 w，8 w对侧dLGN的细胞密度分别是同侧的109.6%，117.1%，110.8%，121.4%和115.6%；与正常对照组相比，术后1 w对侧SC神经元横截面积下降了13.8%（从71.64±0.81 μm2下降至61.76.12±1.24 μm2）。术后8 w下降了24..5% （54.12±4.24 μm2）；对侧SC的细胞密度增多，术后3 d，1 w，2 w，4 w，8 w对侧SC的细胞密度分别是同侧的113.2%，128.8%，124.9%，125.2%和117.5%。 6）免疫荧光法观察发现正常对照组双侧dLGN、SC，可见散在的胶质细胞有弱的GFAP免疫荧光稀疏分布，星状细胞体小且分枝短而细；RIR后3 d，免疫荧光技术染色发现损伤眼对侧dLGN、SC出现GFAP-IR星型胶质细胞的免疫反应性显著增多，GFAP-IR星形胶质细胞表现为伴有许多粗大分支的外观和强烈标记的活性。这种对侧dLGN、SC的GFAP-IR星型胶质细胞免疫反应性高表达持续至整个实验观察期。而同侧dLGN、SC没有明显的变化。定量分析证实与正常对照组相比，RIR后3 d，1 w，2 w，4 w，8 w对侧dLGN的GFAP-IR星型胶质细胞数量显著增加至280.8%，388.5%， 461.5 %，403.8及234.6%；RIR后各时间点对侧SC的GFAP-IR星型胶质细胞数量显著增加至338.1％，438.1％，523.8％，571.4%和300％。 7）用Western blotting方法检测双侧LGN、SC组织MAPKs信号通路中总p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达；高眼压RIR后3 d及2 w双侧LGN、SC组织的p38 MAPK信号通路磷酸化蛋白增加，p-p38/总p38比值增高，与NC组相比差异有统计学意义(P<0.05)； RIR后不同时间对总p38表达变化影响不大。说明高眼压RIR主要影响p38 MAPK 信号通路中蛋白质的磷酸化水平。p38的磷酸化水平显著增高，提示RIR后细胞存活能力下降；p38 MAPK可能参与视觉中枢副凋亡的发生及对细胞增殖和凋亡的调节。 8）利用免疫荧光技术观察对照组未见明显NF-κB p65免疫反应阳性，可见极少量绿色荧光主要分布胞浆中；RIR后3d双侧LGN、SC均可见NF-κB p65免疫反应阳性增加并在细胞核内高表达；这表明高眼压RIR后短期，可诱导双侧LGN、SC的NF-κB p65的阳性表达并激活NF-κB；Western blotting法检测LGN、SC组织NF-κB信号通路中胞核及胞浆蛋白NF-κB p65表达的变化，结果显示RIR后3d及2w双侧LGN、SC的核蛋白NF-κB p65表达均增加，差异与对照组相比具有统计学意义（P<0.05）；RIR后4w对侧SC的核蛋白NF-κB p65表达仍高于对照组（P<0.05）；胞浆蛋白水平与对照组相比，无显著性差异；结果表明高眼压RIR后双侧LGN、SC的NF-κB激活。 结论： 1）急性高眼压RIR损伤后RGCs涉及自噬和副凋亡的激活，各种类型的PCD可作为单一细胞死亡的形式或多种细胞死亡形式共存，参与青光眼性视网膜损伤。针对于不同类型的PCD的研究，有益于探索青光眼发生后神经元死亡治疗性干预的潜在目标； 2）急性高眼压RIR损伤可导致视觉中枢接受损伤眼投射的对侧LGN及SC神经元的退行性变性及副凋亡的发生，副凋亡是急性高眼压RIR引起的跨神经元变性细胞死亡的重要机制之一； 3）急性高眼压RIR损伤可导致视觉中枢接受损伤眼投射的对侧LGN及SC出现早期和持续性的GFAP免疫反应性的增高；表明急性高眼压RIR导致对侧LGN及SC星型胶质细胞活化，而损伤眼同侧未见明显星型胶质细胞活化； 4）急性高眼压RIR损伤可导致视觉中枢LGN及SC组织的p38 MAPK信号通路磷酸化水平增加，NF-κB p65核转位及蛋白表达增加；表明p38 MAPK及NF-κB信号通路参与视觉传导通路的神经元退行性变性及星型胶质细胞活化的调控；活化的星型胶质细胞与p38 MAPK及NF-κB信号通路共同作用才导致了LGN及SC的跨神经元变性及细胞死亡。

Keyword ：

程序性细胞死亡 青光眼 神经变性 星型胶质细胞 炎症反应

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Abstract ：

研究背景： 肝脏移植一直以来是治疗各种终末期肝病的唯一有效方法，但由于供体来源缺乏限制了其广泛应用。肝组织工程可望成为继原位肝移植后又一治疗这类疾病的新方法。其基础是支架材料的选择，对肝细胞培养效果起决定作用。脱细胞基质既能促进细胞的生长，又保持了原有的血管网络结构，是较为理想的支架材料。肝组织工程中脱细胞肝脏基质是最理想的支架材料，但也由于其来源有限而限制了其应用。脾脏的临床来源较肝脏更为广泛，且在肝细胞移植中也可作为肝细胞的生长场所。因此，脾脏可以成为除肝脏之外适合制备培养肝细胞的脱细胞支架的脏器。 研究目的： 本研究的目的可分为两个方面： 1）旨在采用脱细胞基质灌注制备方法制备脾脏脱细胞支架，在制备过程中力求在脱出细胞的基础上，保存较完整的细胞外基质和血管网系统。 2）在支架上种植肝种子细胞后在循环灌注生物反应器中进行体外培养，使其成为具备一定肝脏功能的肝样组织单元，为进一步肝组织工程的建立及临床应用奠定实验基础，并提供科学依据。 研究方法： 本研究的实验过程分为两个阶段： 1）脾脏脱细胞支架的制备及研究：分离、提取3m SD大鼠完整脾脏，采用循环灌注及化学脱细胞法，应用离子型去污剂及非离子型去污剂经由脾动脉进行循环灌注，去除脾脏中的实质细胞，保留脾脏的细胞外基质成分和完整的血管系统。通过大体观察、HE染色、免疫组化染色、扫描电镜观察脾脏支架脱细胞状况，通过DNA定量分析及凝胶电泳测定残余DNA含量及片段长度，应用染料灌注、腐蚀铸型法标记脾脏支架血管网，并对铸型进行MicroCT检测及正置显微镜观察测量，鉴定支架的血管网络功能。 2）构建肝样组织的研究：用改良的Selgen两步胶原酶灌注法提取大鼠原代肝细胞。将其通过灌注的方法由脾脏脱细胞支架的动脉灌注植入脾脏脱细胞支架中，进行两种形式的培养，包括：①在培养基中进行静态培养；②应用自备的循环灌注生物反应器，利用脾脏脱细胞支架的血管网络进行体外动态培养。对构建的肝样组织进行大体观察，并应用HE染色观察肝细胞生长情况；应用白蛋白免疫荧光染色评定动态培养肝细胞蛋白分泌情况；用白蛋白及尿素合成测定评定肝样组织的功能状态，并与三明治培养进行对比。 研究结果： 1）脾脏脱细胞支架的制备：经过9h脱细胞灌注，脾脏变为白色透明状。HE染色可见切片中未见细胞核及细胞质成分，仅留下细胞外基质，基质中存在较多空隙。扫描电镜可见细胞外基质存留，未见细胞成分。免疫组化显示细胞外基质中的四种主要蛋白质，包括I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白，与正常脾脏组织中的蛋白分布基本一致。染料灌注发现染料可以沿原有血管网络进入脾脏支架，经静脉流出。腐蚀血管铸型可见完整脾脏血管网络。将所获得的血管铸型进行正置显微镜观察测量，可见血管铸型连续，其中较小血管的直径可达7.63±1.36μm。 2）肝样组织构建：应用改进的Selgen两步胶原酶灌注法分离大鼠原代肝细胞可以获得（1.74±0.33）×108/只的原代肝细胞，平均肝细胞活力为 87.04%± 5.77% 。将获取的原代肝细胞采用两步间歇的方法注入脾脏脱细胞支架，种植率可达90.7%±4.2%。HE染色见肝细胞在静态培养时细胞主要聚集在脾脏血管网络系统内，少量进入血管周围脾脏实质内；动态培养直接灌注组在支架内仅见极少量细胞；动态培养静置6h后再灌注组支架内可见细胞生长，随时间延长细胞数有所增加，细胞主要分布在血管网络系统周围。动态培养组Alb免疫荧光显示肝细胞内荧光强度逐渐增强，在第7d最强，第10d荧光强度明显减弱。肝细胞白蛋白分泌于静态培养第5d（80.62 ± 9.17μg/107cell/24h），动态定植后灌注培养第7d（102.24 ± 5.12 μg/107cell/24h），三明治培养第5d（83.02 ± 4.13μg/107cell/24h）达到峰值，以后逐渐下降。尿素合成在静态培养组呈逐渐下降趋势，而在动态培养组及三明治培养组中在第5d达到峰值（58.26±7.16 μg/107cell/24h /55.66 ± 7.29 μg/107cell/24h），后逐渐下降，但动态培养的下降趋势较小。 研究结论： 1）应用离子型及非离子型去污剂对脾脏进行循环灌注，可以有效去除脾脏内的细胞，保留细胞外基质。通过灌注所形成的支架原有血管网络系统具备良好的血管网络功能； 2）成功应用改进的Selgen两步胶原酶灌注法分离大鼠原代肝细胞，并在制备的脾脏脱细胞支架上培养。所培养的肝样组织中的肝细胞表现出良好的生长增殖趋势及生理功能。本实验在体外构建了具有一定功能的肝样组织。

Keyword ：

肝样组织 肝脏 肝组织工程 脾脏 脾脏脱细胞基质 脱细胞 支架

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